甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺對OVA致敏小鼠樹突狀細胞調(diào)控Th17-Treg免疫平衡作用的研究.pdf

1、背景
　　樹突狀細胞（Dendriticcells,DCs）對輔助性T細胞17（Thelpcell17,Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（RegulatoryTcell,Treg）平衡的調(diào)控是免疫學研究中目前最為活躍的研究領域之一。Treg和新近發(fā)現(xiàn)的Th17是機體存在的兩種不同于Th1和Th2的CD4+T細胞新亞型。Thl7細胞介導炎癥反應，Treg細胞維持免疫耐受，機體處于正常狀態(tài)下二者保持平衡。新近研究發(fā)現(xiàn)，在諸如類風濕關節(jié)炎（Rh

2、eumatoidarthritis,RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus,SLE）等自身免疫性疾病中存在Th17/Treg細胞失衡，進而誘導異常免疫應答[1]。位于免疫調(diào)節(jié)上游的機體最強的抗原提呈細胞——樹突狀細胞（Dendriticcells,DCs）對于上述免疫平衡起到了關鍵的調(diào)控作用[2]。改變病情抗風濕藥（diseasemodifyinganti-rheumaticdrugs,DMARDs

3、）的聯(lián)合使用是治療自身免疫性疾病的重要策略。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）等DMARDs藥物對樹突狀細胞調(diào)控Th17/Treg免疫平衡的影響國內(nèi)外尚未見報道。通過10余年的臨床與基礎研究，我們已證實周期特異性藥物MTX與周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）聯(lián)合治療類風濕關節(jié)炎具有協(xié)同效應。鑒于此，本課題從樹突狀細胞的角度進行協(xié)同機制的研究，探討MTX聯(lián)合CTX是否通過影響DC功能，最終重建T

4、h17/Treg免疫平衡。
　　目的
　　1.研究單用MTX、單用CTX以及MTX聯(lián)合CTX對DC成熟度的影響；
　　2.研究各組DC成熟度與DC刺激T細胞增殖能力的相關性；
　　3.初步探討MTX聯(lián)合CTX作用下，DC對Th17/Treg細胞平衡調(diào)控作用的影響。
　　方法
　　建立雄性C57小鼠的卵清蛋白（ovalbumin,OVA）致敏模型，隨機分為OVA模型對照組、MTX組（3.03mg.kg-

5、1.w-1）、CTX組（80.88mg.kg-1.3w-1）及MTX聯(lián)合CTX組（MTX3.03mg.kg-1.w-1，CTX80.88mg.kg-1.3w-1）。OVA免疫后2d開始給藥，共9周，于0、3、6、9周4個時點進行實驗。采集各組小鼠骨髓，誘導培養(yǎng)DC，流式細胞儀檢測各組DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達；各組DC與同種異體正常小鼠CD4+T細胞共培養(yǎng)，3H-TdR檢測T細胞增殖；進一步分析MTX

6、聯(lián)合CTX作用下的DC與Th17/Treg細胞水平的相關性。
　　結(jié)果
　　1.給藥前，檢測空白對照組與OVA組DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達，后者表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　　2.隨著給藥時間的延長，DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達在各給藥組中均呈下降趨勢（P<0.05）；
　　3.MTX聯(lián)合CTX治療組表面分子的表達下降最明顯

7、。第9周，聯(lián)合組與OVA組及單藥組比較，表面分子表達差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），單藥組與OVA組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），單藥組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；
　　4.第9周各組DC與同種異體CD4+T細胞共培養(yǎng)，檢測T淋巴細胞增殖，結(jié)果顯示：與單純T細胞對照組比較，OVA組、MTX組及CTX組T細胞增殖升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），聯(lián)合組T細胞增殖無顯著差異（t=0.767,P=0.4

8、61）；與OVA模型對照組比較，各給藥組T細胞增殖均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；各給藥組間比較，聯(lián)合組較MTX或CTX單藥組增殖下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.998,P=0.012;t=2.703,P=0.035），單藥組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；
　　5.MTX聯(lián)合CTX組在0、3、6、9周各表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達與相對應的Th17/Treg細胞比值呈正相關（分別為：r

9、=0.862，P<0.001；r=0.855，P<0.001；r=0.865，P<0.001；r=0.860，P<0.001）。
　　結(jié)論
　　1.DC成熟程度與DC刺激T細胞增殖的能力平行；
　　2.DC成熟程度升高，Th17炎性反應活躍；相反，DC成熟程度降低，Treg免疫抑制增強。各用藥組均可抑制DC成熟，進而Th17/Treg比值降低，MTX聯(lián)合CTX對其影響最為顯著；
　　3.MTX聯(lián)合CTX明顯抑制D