p38MAPK和STAT3在LPS刺激小鼠肺泡巨噬細胞功能變化中的作用.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種致病因素(如創(chuàng)傷、感染、缺血再灌注、燒傷等)導致的急性進行性呼吸衰竭，嚴重的ALI被定義為急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)，其發(fā)病機制至今尚不完全清楚。脂多糖(lipopolysaca charide，LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞壁上的成分，它能夠誘發(fā)重癥肺炎，從而引起ARDS。ALI起病急，進展快，至

2、今尚無特異性治療。近幾年盡管采用了新的通氣技術和其它治療措施如糖皮質激素等，ARDS的死亡率仍高達40％-60％。如何防止ALI的發(fā)展引起人們的高度重視。有研究表明ALI的后果依賴于致炎因子和抗炎因子的平衡。炎癥因子種類很多，但產生炎癥因子的信號途徑較少。因此我們從信號轉導途徑方面研究ALI的發(fā)病機制，為臨床防治ALI提供理論依據。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs

3、)是多種信號途徑的交匯點。在微生物感染所致的免疫反應中，巨噬細胞中的MAPKs發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用。信號轉導及轉錄活化因子(signal transducers and activators oftranscription，STAT)是一類脫氧核糖核酸結合蛋白，是細胞因子產生的關鍵調節(jié)者。關于LPS與細胞因子生成的研究結果顯示，干預LPS的細胞內信號轉導是人為控制炎癥級聯(lián)反應的重要途徑，大量研究顯示MAPKs在LPS信號的細胞內傳遞中具有

4、重要作用，是人為控LPS炎癥反應的潛在靶位。LPS主要和肺泡巨噬細胞發(fā)生作用，巨噬細胞組成肺組織第一道防線。本實驗以LPS刺激小鼠肺泡巨噬細胞株(MH-S cells)為研究對象，觀察細胞內p-STAT3表達水平及細胞上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，及用p38的特異性抑制劑SB203580干預后p-STAT3表達的變化。從信號轉導途徑探討LPS致ALI的機制，為臨床防治ALI提供理論依據。 方法： 1.酶聯(lián)免

5、疫吸附試劑盒(ELISA試劑盒)檢測細胞上清液中TNA-α的濃度。首先常規(guī)培養(yǎng)傳代MH-S細胞株，細胞傳代時進行細胞計數，調節(jié)細胞濃度為5x106/ml，于24孔板中培養(yǎng)過夜，隨機分為5組。①對照組：加入與實驗組等體積的無血清1640培養(yǎng)液；②LPS組：LPS終濃度100ng/ml，分別刺激90min、2h 4h、6h、12h后取細胞上清液；③SB5+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為5μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS

6、終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取細胞上清液；④SB10+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取細胞上清液；⑤SB15+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為15μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h

7、、12h后取細胞上清液。 -80℃保存細胞上清液，ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中TNF-α的含量。 2.Western blot方法檢測SB203580對LPS誘導MH-S細胞STAT3磷酸化的影響。實驗共分5組：①對照組：加入與實驗組等體積的兀血清1640培養(yǎng)液；②LPS15min組：LPS終濃度100ng/ml，刺激15分鐘；③LPS30min組：LPS終濃度100ng/ml，刺激30分鐘；④SB10+LPS1

8、5min組：SB203580終濃度10μM，LPS終濃度100ng/ml，刺激15分鐘，在LPS刺激前20分鐘用SB進行干預；⑤SB10+LPS30min組：SB203580終濃度10μM，LPS終濃度100ng/ml，刺激30分鐘，在LPS刺激前20分鐘用SB進行干預。各實驗組細胞刺激成功后收集細胞，離心(1500rpm，4℃，10min)，棄去上清，-80℃保存細胞用于提取總蛋白，Western-blot技術，檢測細胞內p-STAT

9、3表達。 3.免疫細胞化學方法檢測LPS誘導的MH-S細胞內磷酸化STAT3的表達。于6孔板中上述各組細胞爬片，實驗分組同Western blot，爬滿后做免疫細胞化學。 數據以均數土標準差(-x±s)表示。各組比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，如有顯著性進一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。 結果： (1)ELISA法顯示細胞

10、上清液中TNF-α含量變化。LPS刺激MH-S細胞后，細胞上清液中TNF-α含量增加，LPS刺激90min；TNF-α含量開始升高，4h和6h達最高值，12h含量降低。經單因素方差分析，對照組、LPS組與SB+LPS組，三組間TNF-α表達水平差異顯著(P＜0.05)，SB203580(10μM和 15μM)預處理，顯著抑制LPS誘導的TNF-α含量增加，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且與SB的劑量呈正相關。SB20

11、3580(5μM)組，TNF-α含量雖有下降趨勢，但與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (2)Western blot結果顯示LPS15min和LPS30min組磷酸化STAT3蛋白表達水平高于對照組和SB抑制組，LPS30min組表達水平高于LPS15min組。 (3)免疫細胞化學結果表明：對照組細胞幾乎無黃染，LPS15min組細胞開始出現(xiàn)黃染，LPS30min組細胞黃染增強，用SB203580干預后細

12、胞黃染變淡。經單因素方差分析，各組與對照組比較，p-STAT3表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；LP15min與SB10+LPS15min組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；LPS30min與SB10+LPS30min組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結論： 1.LPS刺激MH-S細胞引起細胞上清中TNF-α泌增加；用p38MAPK的抑制劑SB203580干預后，TNF-α的分泌呈劑量依賴性減少。