熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B’調(diào)控的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、近年來(lái)，基因治療已成為腫瘤治療的主要方法之一。在腫瘤基因治療中，啟動(dòng)子可以通過(guò)控制治療基因表達(dá)的時(shí)間和水平，達(dá)到腫瘤靶向治療的目的。HSP70B'作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，參與腫瘤免疫保護(hù)作用;而且HSP70B'啟動(dòng)子還表現(xiàn)出獨(dú)特的熱誘導(dǎo)性，它在正常的細(xì)胞和組織中不會(huì)表達(dá)，只有在高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞中才會(huì)表達(dá)。這一獨(dú)特的生物學(xué)特征，使其在基因工程治療腫瘤的研究中具有重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先

2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出HSP70B'啟動(dòng)子，然后將HSP70B'啟動(dòng)子插入到pEGFP-C1載體上構(gòu)建了載體pEGFP-HSP70B'，然后把重組質(zhì)粒pEGFP-HSP70B'轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，通過(guò)考察綠色熒光蛋白的表達(dá)優(yōu)化HSP70B'啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。在此基礎(chǔ)上，我們又構(gòu)建了以熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B'啟動(dòng)子調(diào)控的靶向hTERT的RNAi表達(dá)載體p-shTERT-HSP70B'。將重組質(zhì)粒用ExGen500轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞

3、MCF-7，考察了重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，以及靶向hTERT mRNA的RNAi效應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)溫度達(dá)到40℃以上時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加綠色熒光蛋白的量增加。當(dāng)誘導(dǎo)溫度達(dá)到42℃時(shí)，時(shí)間為40 min時(shí)，綠色熒光蛋白的強(qiáng)度最強(qiáng)，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變化。誘導(dǎo)溫度達(dá)到44℃時(shí)，我們能明顯看到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化并回縮變圓。重組質(zhì)粒p-shTERT-HSP70B'在42℃誘導(dǎo)40min條件下，對(duì)

4、細(xì)胞的抑制率為39.9％;乳腺癌MCF-7細(xì)胞hTERT mRNA的抑制率達(dá)到了69％;并且其細(xì)胞凋亡結(jié)果也顯示其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到了31％，細(xì)胞周期抑制阻滯在G1期。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B'調(diào)控的RNAi表達(dá)載體p-shTERT-HSP70B'可以有效的抑制乳腺癌細(xì)胞內(nèi)hTERT mRNA的表達(dá)、引起細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期的分布、最終抑制腫瘤增殖。本實(shí)驗(yàn)為熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B'在RNAi中的應(yīng)用奠

5、定了的基礎(chǔ)。
　　 熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B'的轉(zhuǎn)錄活性需要熱量激活，因此可以實(shí)現(xiàn)基因治療和熱療有機(jī)結(jié)合。有研究表明，經(jīng)修飾的超短碳納米管在13.56 MHz的射頻場(chǎng)中，可以將射頻導(dǎo)微波能量有效轉(zhuǎn)化為熱能，從而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的熱損傷。因此，本研究對(duì)碳納米管作為熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子HSP70B'調(diào)控的RNAi表達(dá)載體的納米轉(zhuǎn)運(yùn)載體的可行性進(jìn)行了初步探索。我們用小分子量的PEI(MW600)對(duì)碳納米管進(jìn)行改性，提高其水溶性，負(fù)載重組載體p-