狂犬病毒先導RNA及其宿主互作蛋白的功能研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病，人與所有的溫血動物都易感并可傳播病毒。該病在全球分布廣泛，且一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100％，因此給人類健康帶來巨大的威脅。全球每年有5.9萬人因狂犬病死亡，其中有絕大部分發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國家。狂犬病毒屬于狂犬病毒屬彈狀病毒科，病毒基因組編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白，病毒在轉(zhuǎn)錄的過程中不僅產(chǎn)生這五種結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA，也會產(chǎn)生一段5'端沒有帽子結(jié)構(gòu)，3'端沒有polyA尾巴的非編碼RNA，名為先導RNA

2、。
　　有研究用末端標記的狂犬病毒基因組與被固定毒感染12小時的BHK-21細胞產(chǎn)物做雜交，檢測到狂犬病毒感染后產(chǎn)生的先導RNA，長度主要是56 nt和58 nt，其中56 nt的先導RNA的量約是58 nt長度的兩倍。并且檢測被固定毒感染24小時的細胞時，結(jié)果相同，但先導RNA的量比感染后12小時少。該研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了先導RNA有其他的長度，如43 nt、60 nt。狂犬病毒和水泡性口炎病毒的核蛋白都能通過與先導RNA的互作來

3、影響病毒轉(zhuǎn)錄和復制之間的轉(zhuǎn)換，決定了病毒是以轉(zhuǎn)錄為主還是以復制為主。在狂犬病毒感染時，狂犬病毒核蛋白與先導RNA的互作比核蛋白與核蛋白mRNA的互作、核蛋白和其他非病毒RNA的互作都更強，證明與非病毒RNA和病毒的mRNA相比，核蛋白會優(yōu)先結(jié)合先導RNA。核蛋白和磷蛋白同時表達時，磷蛋白會使核蛋白結(jié)合其他RNA的能力降低，但不影響核蛋白結(jié)合先導RNA。但是，先導RNA本身的作用以及先導RNA表達的調(diào)控機制并不清楚，本實驗旨在研究先導RN

4、A的產(chǎn)生、功能以及與宿主之間的關(guān)系。
　　以狂犬病毒街毒株DRV-AH08作為研究對象，來研究狂犬病毒的先導RNA。DRV-AH08感染小鼠后提取總RNA建先導RNA文庫，通過Sanger測序我們發(fā)現(xiàn)，DRV-AH08的先導RNA形式多樣，但最主要的長度是64 nt。隨后我們用DRV-AH08感染SK-N-SH細胞，并在感染早期提取總RNA建先導RNA文庫，然后做高通量測序，高通量測序的結(jié)果顯示先導RNA的主要長度仍是64 nt。

5、雖然先導RNA長度不同，但是我們預測了56 nt、58 nt和64 nt的先導RNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，它們的二級結(jié)構(gòu)相似。為了進一步研究先導RNA的功能，我們利用人類腺病毒表達載體，在細胞中和活體中過表達先導RNA。首先是細胞中，用表達載體過表達不同長度的先導RNA，然后感染不同劑量的狂犬病毒（0.01MOI和0.1MOI）發(fā)現(xiàn)56 nt、58 nt和64 nt長度的先導RNA均能抑制狂犬病毒的感染，并且我們用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的64nt先導R

6、NA轉(zhuǎn)染細胞驗證了先導RNA對狂犬病毒感染的抑制作用。然后我們將過表達先導RNA和過表達對照RNA的人類腺病毒通過腦三維立體定位注射的方式分別注射到同一只小鼠的左右腦海馬區(qū)，再感染狂犬病毒，最后發(fā)現(xiàn)在活體水平過表達先導RNA仍然能抑制狂犬病毒的感染。
　　同時我們也在SK-N-SH細胞中再次驗證了，過表達先導RNA時，狂犬病毒的基因組RNA顯著性減少。通過RNA免疫共沉淀試驗我們發(fā)現(xiàn)，先導RNA存在時，能抑制狂犬病毒核蛋白與基因組

7、RNA結(jié)合。這表明，先導RNA可以通過抑制核蛋白與基因組結(jié)合來抑制狂犬病毒的復制。
　　RNA和蛋白互作試驗證實宿主中的熱休克同源70 KD蛋白，Hsc70，可以與先導RNA互作，并且這種互作是直接的互作。Hsc70和先導RNA互作3D結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果顯示，Hsc70的核酸結(jié)合區(qū)域可能是結(jié)合了先導RNA51 nt-59 nt的AU富集區(qū)。抑制Hsc70的表達可以促進先導RNA的水平升高。同時Hsc70表達水平降低，會導致狂犬病毒的復制

8、減少。而反過來，狂犬病毒感染后也會影響Hsc70的表達，狂犬病毒感染后2小時，Hsc70的水平顯著下降，但是感染后36小時，Hsc70的水平又顯著升高。這種不同的變化促使我們進一步研究了Hsc70、先導RNA和病毒基因組RNA之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)狂犬病毒感染早期會抑制Hsc70的產(chǎn)生，從而導致先導RNA含量增加，進而抑制了病毒的復制，而在感染晚期，Hsc70的表達水平升高，先導RNA含量下降，病毒開始大量復制。這種病毒自我調(diào)節(jié)復制的現(xiàn)象