巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抗炎作用及參與內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為以下兩個(gè)部分： 第一部分巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抗炎作用的機(jī)制研究 炎癥是人體對(duì)感染、體內(nèi)抗原抗體結(jié)合以及機(jī)械損傷的一種自身反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)對(duì)人體是有益的，而過(guò)度的或持續(xù)的炎癥反應(yīng)卻會(huì)引起組織損傷和誘發(fā)疾病。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)可以糾正炎癥反應(yīng)的失調(diào)，在臨床中常被用來(lái)治療包括膿毒性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征、急性呼吸窘迫綜合征等急性炎癥反應(yīng)引起的疾病和哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

2、炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化、銀屑病等慢性炎癥反應(yīng)異常引起的疾病。GC主要是通過(guò)其與糖皮質(zhì)激素受體(GR)的結(jié)合，經(jīng)不同途徑發(fā)揮作用。然而這種多效性作用也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，引起兒童生長(zhǎng)遲緩，免疫抑制，高血壓，抑制傷口修復(fù)，骨質(zhì)疏松以及代謝紊亂等。 Annexin1作為一種磷脂酶A2(PLA2)的抑制蛋白，可以影響許多炎癥反應(yīng)復(fù)合物的形成，例如花生四烯酸代謝后的脂質(zhì)炎癥介質(zhì)。體內(nèi)PLA2存在cPLA2(胞漿型)和sPL

3、A2(血清型)2種形式。cPLA2是脂質(zhì)二十烷類炎癥介質(zhì)合成釋放的關(guān)鍵酶，其活性的控制是調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程的中心。最近研究表明內(nèi)源性Annexin1特異性作用于cPLA2，全長(zhǎng)的Annexin1和羧基末端區(qū)域都可以抑制cPLA2活性，而外源性Annexin1及其氨基末端片斷與其膜受體相互作用抑制cPLA2活性。Annexin1也抑制其他一些參與炎癥的酶的表達(dá)和/或活性，如巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)型環(huán)氧合

4、酶(COX-2)。在巨噬細(xì)胞，Annexin1誘導(dǎo)IL-10釋放，IL-10是一個(gè)潛在的抗炎細(xì)胞因子，能夠抑制細(xì)胞因子對(duì)COX和NOS表達(dá)的誘導(dǎo)。此外，糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)并激活A(yù)nnexin I，通過(guò)抑制cPLA2α阻止花生四烯酸的產(chǎn)生和向類花生酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變(如，前列腺素，血栓素，前列環(huán)素和白三烯)，從而發(fā)揮其強(qiáng)大的抗炎作用。 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，M

5、IF)是一種主要由巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞及垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)素細(xì)胞等合成的細(xì)胞因子。細(xì)菌、毒素及一些細(xì)胞因子刺激可誘導(dǎo)MIF釋放，從而限制巨噬細(xì)胞的遷移。GC在全身免疫炎癥反應(yīng)中具有廣泛的作用。外源性GC可抑制整個(gè)免疫炎癥系統(tǒng)，包括促炎因子的表達(dá)，T細(xì)胞的激活，粘附分子的表達(dá)，細(xì)胞遷移與效應(yīng)分子的生成等；內(nèi)源性GC以一種雙相、濃度依賴性的方式調(diào)節(jié)免疫炎癥系統(tǒng)。迄今為止，MIF是唯一被認(rèn)為能負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的細(xì)胞因子，它可能與局部或

6、全身炎癥、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，亦可能是GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵因子。MIF是如何對(duì)抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用的，其機(jī)制至今仍未完全闡明。 基于以上研究現(xiàn)狀，我們提出這樣的問(wèn)題：既然糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)Annexin1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用，那么MIF負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的抗炎作用是否與Annexin1有關(guān)?我們將針對(duì)這一問(wèn)題深入探討，從而進(jìn)一步明確MIF負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抗炎作用的分子機(jī)制。 我們首先觀察了MIF是否具有

7、負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)釋放的作用。用脂多糖(LPS)、MIF、地塞米松(Dex)分別或相繼刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7后用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)的含量。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)釋放的作用是否與Annexin1相關(guān)，用Western blotting的方法檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞胞漿中Annexin1的蛋白表達(dá)變化。從反

8、向證明的角度，我們用RNA干擾(RNAi)的方法阻斷細(xì)胞內(nèi)MIF的表達(dá)，再觀察Dex是否能增強(qiáng)Annexin1的表達(dá)。在明確了MIF和Annexin1之間的關(guān)系后，我們進(jìn)一步用Western blotting方法檢測(cè)了在抑制內(nèi)源性MIF表達(dá)或給予外源性重組MIF刺激后Annexin1的下游信號(hào)蛋白胞漿內(nèi)磷脂酶A2α(cPLA2α)的表達(dá)變化。最后在抑制內(nèi)源性MIF表達(dá)的情況下，用ELISA方法檢測(cè)了Dex刺激后細(xì)胞上清液中PGE2和LT

9、B4的含量。 結(jié)論：在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7中，MIF通過(guò)抑制抗炎蛋白Annexin1的表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)PGE2和LTB4巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素抗炎作用及參與內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究的產(chǎn)生。Annexin1作為MIF和糖皮質(zhì)激素之間作用的關(guān)鍵性蛋白，有望成為治療炎癥性疾病的新靶點(diǎn)。 第二部分巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子參與內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究 血管內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)

10、節(jié)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有舉足輕重的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞維持著血管收縮與舒張、抑制與刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖與移行、凝血與纖溶活性等多方面的平衡。已知血管內(nèi)皮細(xì)胞是胰島素的效應(yīng)細(xì)胞，胰島素與內(nèi)皮細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合后，通過(guò)促使內(nèi)皮細(xì)胞合成及釋放一氧化氮(NO)增加而實(shí)現(xiàn)其血管舒張的生理功能。NO是迄今所知最強(qiáng)有力的內(nèi)源性血管舒張因子，在維持正常血管張力方面起主要作用。若機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)胰島素抵抗的狀態(tài)，如肥胖、2型糖尿病、高血壓等情況發(fā)生，胰島素

11、介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能受損，內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生減少，從而誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗。 多年的研究認(rèn)為內(nèi)皮功能紊亂是誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的基礎(chǔ)，而炎癥則是導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂的觸發(fā)因素。已證實(shí)IL-6和TNF-α這兩個(gè)炎癥因子均能影響內(nèi)皮功能從而誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗，且是通過(guò)干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。 本論文的第一部分內(nèi)容中介紹的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是一個(gè)強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，它不僅能負(fù)向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的抗

12、炎作用，且近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)MIF與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖、高血壓等心血管及代謝系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。鑒于胰島素抵抗、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的密切關(guān)系，我們提出了這樣的假設(shè)，MIF是否參與了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的過(guò)程，如果參與，那么其具體機(jī)制是怎樣的?對(duì)于上述假設(shè)的研究目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，即作為本部分的研究?jī)?nèi)容。 我們以人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為研究對(duì)象，首先觀察了胰島素對(duì)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生和釋放NO的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步

13、觀察MIF和胰島素聯(lián)合刺激對(duì)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生和釋放NO的作用，從而明確MIF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。在明確MIF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的影響后，我們從胰島素介導(dǎo)NO產(chǎn)生和釋放的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3-kinase入手，主要針對(duì)了胰島素受體底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇三激酶(PI3-kinase)亞基p85和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)這幾個(gè)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵性蛋白，通過(guò)檢測(cè)IRS-1的磷酸化、PI3-kinase亞基p85

14、的活化和eNOS的磷酸化來(lái)反應(yīng)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化(是否受阻或減弱)。研究MIF是否作用于該條信號(hào)通路上的幾個(gè)關(guān)鍵性蛋白，旨在揭示MIF影響內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰島素能以劑量依賴和時(shí)間依賴方式促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，但如果MIF聯(lián)合胰島素刺激，則大大減少內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放。NO，用MIF拮抗劑則能基本恢復(fù)胰島素釋放NO的能力。從效應(yīng)來(lái)看，MIF和胰島素之間存在相互拮抗的作用。在此基礎(chǔ)上，我們以胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

15、通路中的一條途徑(PI3-kinase途徑)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)MIF可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，MIF增強(qiáng)IRS-1的絲氨酸(位點(diǎn)312和616)磷酸化并降低IRS-1的酪氨酸(位點(diǎn)612)磷酸化；另一方面，MIF顯著降低了IRS蛋白與下游轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3-kinase中活性亞基p85的結(jié)合，繼而減少了eNOS的活化，從而減少NO合成和釋放。且MIF拮抗劑能部分抵消上述MIF對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中幾個(gè)關(guān)鍵性蛋白的影響。

16、 我們的研究結(jié)果證實(shí)了MIF干擾了胰島素介導(dǎo)的NO釋放，影響了內(nèi)皮細(xì)胞維持正常的血管舒張，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而參與了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的發(fā)生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)不僅補(bǔ)充和豐富了現(xiàn)有的胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制，而且進(jìn)一步證實(shí)了炎癥、胰島素抵抗之間的密切關(guān)系。此外，研究還發(fā)現(xiàn)MIF主要是通過(guò)作用于胰島素介導(dǎo)的PI3-kinase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的幾個(gè)關(guān)鍵性蛋白(IRS-1、PI3-kinase p85、eNOS)來(lái)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能的。上述結(jié)果為臨床防