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文檔簡介
1、目的:研究γ電離輻射對破骨細胞代謝的效應(yīng),并掌握相應(yīng)的輻照劑量,初步探究其效應(yīng)的機制。有利于進一步了解電離輻射改變骨代謝的途徑,為防治電離輻射所致的骨損害提供新的思路。
方法:本研究主要內(nèi)容包括四部分。第一部分研究2Gyγ射線全身單次輻照對小鼠體內(nèi)破骨細胞代謝和骨吸收的影響。C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組和輻照組。雙抗體夾心ELISA法測定輻照后不同時間點小鼠血清中骨代謝相關(guān)指標TRAP-5b、sRANKL、CTX-
2、1和TNF-α;采用甲基百里香酚藍比色法測定血清中Ca2+濃度;TRAP染色骨病理切片觀察破骨細胞形態(tài)變化。第二部分建立體外破骨細胞培養(yǎng)模型。通過使用小鼠重組sRANKL和轉(zhuǎn)移骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液兩種方法分別誘導破骨前體細胞株RAW264.7和骨髓單核細胞為破骨細胞。第三部分研究γ射線對RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響。在sRANKL誘導RAW264.7細胞分化為破骨細胞的過程中給予γ射線輻照,計數(shù)形成的破骨細胞數(shù)量和檢測破骨
3、細胞代謝指標TRAP-5b,并用流式細胞術(shù)檢測輻照后細胞內(nèi)ROS和Ca2-含量;第四部分研究γ射線對骨髓基質(zhì)細胞調(diào)控破骨細胞代謝的影響。不同劑量的γ射線全身單次照射C57BL/6雄性小鼠后第1、2、3和7天,使用一步法RT-PCR檢測骨髓細胞中RANKL mRNA和OPG mRNA。給予體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞γ射線照射,ELISA法和共聚焦定量法檢測其RANKL蛋白的表達,并使用其條件培養(yǎng)液誘導骨髓單核細胞分化為破骨細胞。
4、 結(jié)果:各部分對應(yīng)的試驗結(jié)果如下:
(1)輻照后第4天,與對照組相比,輻照組小鼠血清中TRAP-5b、CTX-1、sRANKL和TNF-α含量分別升高了37.30%、47.14%、19.55%和17.67%(P<0.05),輻照組小鼠骨內(nèi)破骨細胞呈代謝活化相。輻照后第90天,輻照組小鼠血清TRAP-5b和CTX-1水平仍然要高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
(2)兩種方法均成功地誘導出由多個細
5、胞互相融合形成的TRAP陽性多核破骨細胞。加入外源性的sRANKL刺激RAW264.7誘導出的破骨細胞比骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液刺激骨髓單核細胞形成的破骨細胞形態(tài)較大,數(shù)量也較多。
(3)1、2、4Gy輻照組破骨細胞數(shù)量與對照組相比增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001);破骨細胞培養(yǎng)液中TRAP-5b的含量隨著輻照劑量的增加而升高,兩者呈正向直線線性相關(guān)(r2=0.919,P=0.041)。輻照后,細胞內(nèi)ROS水平和Ca
6、2-水平均升高。
(4)輻照小鼠后3天,2、4和6Gy組的骨髓細胞RANKL/OPG mRNA比值。
與對照組相比明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),RANKL/OPG mRNA比值的改變依賴RANKL mRNA的變化。γ射線輻照后,骨髓基質(zhì)細胞的RANKL蛋白表達在輻照后早期增加。RANKL的表達升高具有劑量依賴性和時間依賴性,輻照劑量越大,RANKL升高得越早。輻照組骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液誘導形
7、成的破骨細胞數(shù)量和TRAP-5b水平比對照組高,輻照劑量為2Gy時尤為明顯。
結(jié)論:2Gy的γ射線全身單次輻照可促進小鼠破骨細胞代謝,骨吸收增加,破骨細胞的代謝增強是電離輻照導致的骨損害的重要原因之一。γ射線促進破骨細胞代謝活化的機制包括如下:
1.γ射線通過升高破骨細胞活化的信號分子ROS和Ca2+,以劑量依賴的方式促進破骨前體細胞分化形成破骨細胞。
2.γ射線以劑量和時間依賴的方式早期促進骨
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