茶樹育性相關基因的克隆與表達研究.pdf

1、茶樹是一種廣泛種植的經濟作物，由于自交不親和、雜交結實率低和品種間雜交結實率差異大，導致茶樹遺傳背景復雜、雜交育種效率低，限制了遺傳學研究和遺傳改良相關工作的開展。本研究以茶樹自交不親和機制為切入點，使用轉錄組學的方法，發(fā)掘茶樹育性相關基因，對關鍵基因進行克隆，并通過基因分型、基因表達和蛋白的原核表達等手段，研究關鍵基因在茶樹育性分子機制中的作用。本研究主要結果如下:
　　1.使用熒光顯微鏡觀察自交（‘福鼎大白茶’ב福鼎大白茶’

2、）和異交（‘福鼎大白茶’ב中茶108’）授粉花柱中花粉管的生長差異。發(fā)現(xiàn)授粉24 h～48 h自交花粉管的生長速度明顯慢于異交花粉管;授粉72 h，異交和自交花粉管均長至花柱基部。表明自交花粉管在花柱中的生長受到了一定程度的抑制，到達花柱基部的時間有明顯延遲。
　　2.為了明確自交花粉管生長受抑的分子機制，本文使用轉錄組學的方法研究了茶樹自交(self-pollination，SP)和異交（cross-pollination，C

3、P）授粉24h、48h和72h后花柱中基因表達的差異。獨立構建6個轉錄組測序文庫(CP24、CP48、CP72、SP24、SP48和SP72)分別進行測序，共得到了63762個Unigene。通過比較SP和CP樣本間的轉錄組數(shù)據(jù)，篩選到大量的差異表達基因，其中包括Ca2+信號轉導、細胞凋亡、植物-病原菌互作和活性氧代謝等過程相關的基因，為茶樹育性相關重要基因的篩選奠定了基礎。然后研究了SP和CP樣本中隨授粉時間變化的基因表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)花

4、柱對自花和異花花粉管具有完全不同的響應模式，其中83個參與氧化還原過程基因的上調表達在SP樣本中有明顯的延遲，與自交花粉管生長受抑的表型一致，推測這些基因可能直接參與了花粉管生長的調控。
　　3.對自交和異交授粉的茶樹子房進行了轉錄組測序，拼接得到51200個Unigene。與根、葉片和花柱的轉錄組數(shù)據(jù)進行比較，篩選到99個在茶樹子房中特異表達的基因，這些基因在花粉-雌蕊互作、花粉管引導和雙受精過程中具有重要功能。使用熒光定量PC

5、R的方法，研究了51個與IAA、乙烯、ABA和GA信號轉導相關Unigene，在SP和CP授粉子房中的表達規(guī)律，篩選到6個表達規(guī)律具有顯著差異的Unigene，分別為:GID1、SAUR、GH3.6、GH3.1、IAA29和ARF1，這些基因可能在茶樹花粉管-子房互作階段具有重要功能。
　　4.S-RNase基因是配子體型自交不親和機制(gametophytic self-incompatibility，GSI)中的雌性決定因子。

6、本研究從轉錄組差異表達基因中，篩選并克隆了一個CsS-RNase基因(KU852488)，該基因全長1121 bp，開放閱讀框全長717bp，編碼283個氨基酸殘基;該基因主要在花柱中表達;自交授粉花柱中CsS-RNase的上調表達明顯早于異交花柱，且授粉24h自交花柱中表達量顯著高于異交花柱，與自花花粉管受抑時間一致。檢測該基因在11個茶樹品種（系）中的基因型，發(fā)現(xiàn)該基因存在豐富的遺傳多態(tài)性。然后將CsS-RNase定位到了實驗室構建

7、的遺傳圖譜上。對CsS-RNase基因進行原核表達，成功分離到了目標蛋白。使用不同CsS-RNase蛋白濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，發(fā)現(xiàn)CsS-RNase能夠明顯抑制自花花粉管的生長。以上結果表明CsS-RNase符合GSI植物S-RNase基因的典型特征，認為茶樹自交不親和性在分子機制上受GSI機制控制。
　　5.從轉錄組數(shù)據(jù)中篩選到14個具有完整開放閱讀框的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kina

8、ses，CDPKs)基因。使用熒光定量PCR檢測CDPKs的組織表達特異性，發(fā)現(xiàn)5個CsCDPKs基因在花粉中特異表達。然后克隆了這5個CsCDPKs的cDNA全長序列。同源比對發(fā)現(xiàn)，它們與多個擬南芥中參與花粉管極性生長的CDPKs有較高的同源性。5個CsCDPKs隨著花粉培養(yǎng)時間的延長，表達量呈上升趨勢，其中CsCPK3、CsCPK4和CsCPK5在花粉培養(yǎng)初始階段便有快速響應。進一步選擇了CsCPK5設計并合成了硫代修飾的反義寡核苷