川芎嗪和人參皂苷Rg1對Caco-2細胞p-糖蛋白功能和表達的影響.pdf

1、一、目的 研究川芎嗪、人參皂苷Rgl單用以及它們合用時對p-糖蛋白功能和表達的影響。 二、方法 1.細胞培養(yǎng)以及形態(tài)學驗證培養(yǎng)Caco-2細胞、臍靜脈內皮細胞ECV以及建Caco-2單層細胞模型，用于研究川芎嗪和人參皂苷Rgl，對p-糖蛋白功能和表達的影響。Caco-2細胞和ECV細胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)；細胞熒光免疫法進行p-糖蛋白表達驗證；用Transwell板接種Caco-2細胞建立單層模型

2、，采用細胞電位儀、熒光黃及普奈洛爾轉運實驗進行模型驗證。 2.細胞毒性試驗采用MTT法，確定川芎嗪和人參皂苷Rgl的體外最大非細胞毒劑量，保證試驗過程中細胞的活性。 3.羅丹明-123外排試驗以ECV細胞作陰性對照細胞，環(huán)孢素A作為p-糖蛋白功能抑制的陽性對照，使用高效液相紫外法研究川芎嗪和人參皂苷Rgl對p-糖蛋白底物羅丹明-123在Caco-2細胞中外排功能的影響。 4.羅丹明-123轉運試驗環(huán)孢素A作為p-

3、糖蛋白功能抑制的陽性對照，建立Caco-2單層細胞膜型，進一步研究川芎嗪和人參皂苷Rgl對羅丹明-123跨細胞膜轉運功能的影響。 5.p-糖蛋白表達的測定使用流式細胞儀分析川芎嗪和人參皂苷Rgl對Caco-2細胞上p-糖蛋白表達量的影響。 三、結果 1.細胞培養(yǎng)以及形態(tài)學驗證Caco-2和ECV細胞形態(tài)正常；Caco-2單層細胞模型緊密且完整，細胞旁及跨細胞轉運通路通透性良好；Caco-2細胞強表達p-糖蛋白，E

4、CV細胞弱表達p.糖蛋白；Caco-2單層細胞模型成功建立，可用于川芎嗪和人參皂苷Rgl對p-糖蛋白轉運功能；ECV細胞適合作為陰性對照細胞。 2.細胞毒性試驗川芎嗪和人參皂苷Rgl分別在60～240μg/mL和6～24μg/mL范圍內為非細胞毒性劑量，與細胞培養(yǎng)72小時后細胞的存活率大于90％。 3.川芎嗪和人參皂苷Rgl對羅丹明-123外排的影響中、高濃度(120、 240μg/mL)的川芎嗪能夠顯著降低羅丹明-12

5、3從Caco-2細胞的外排(p<0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl對羅丹明-123的外排影響不大，沒有顯著性差異(p>0.05)。高濃度(20μg/mL)人參皂苷Rgl對外排有影響(p<0.05)。中濃度的川芎嗪和人參皂苷Rgl(120、20μg/mL)合用時，對羅丹明-123的外排有顯著的協(xié)同抑制作用排(p<0.05)。 4.川芎嗪和人參皂苷rgl對羅丹明-123跨細胞膜轉運的影響中、高濃度(120、 240μg/mL)的川芎

6、嗪在0.5、1.0和1.5h能夠使羅丹明-123從Caco-2單層細胞的腸腔側到腸內壁側的累積轉運量顯著增加(p<0.os)。中濃度(10μg/mL)的人參皂苷Rgl對羅丹明-123的轉運無顯著影響(p>0.05)，高濃度的人參皂苷Rgl(20μg/mL)使羅丹明-123累積轉運量顯著增加(p<0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl和川芎嗪(120、20μg/mL)合用則對羅丹明-123從腸腔側到腸內壁側的累積轉運量具有協(xié)同增強作用(p<0

7、.05)。 5.川芎嗪和人參皂苷Rgl對Caeo-2細胞膜上p-糖蛋白表達的影響中、高濃度(120、240μg/mL)的川芎嗪使Caco-2細胞的p-糖蛋白表達水平顯著下調(p<0.05)。中、高濃度(10、20μg/mL)的人參皂苷Rgl對p-糖蛋白的表達影響不大(p>0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl與中濃度的川芎嗪(10、120μg/mL)合用后，對p-糖蛋白的下調無協(xié)同作用(p>0.05)。 四、結論 1

8、.川芎嗪是p-糖蛋白的底物，與p-糖蛋白上Rh-123受體競爭性結合，減少p-糖蛋白對細胞內Rh-123的外排，增強Rh-123跨小腸上皮細胞的轉運。同時川芎嗪也是p-糖蛋白的抑制劑，通過直接抑制p-糖蛋白的活性而影響p-糖蛋白功能，長時間應用TMP可通過下調p-糖蛋白的表達水平影響降低腸道P-gp的活性。 2.人參皂苷Rgl是p-糖蛋白的抑制劑，高濃度的人參皂苷Rgl通過直接抑制p-糖蛋白的外排轉運功能而影響腸道p-糖蛋白的功