脂肪酸合成與代謝通路對橘小實蠅RNAi免疫耐受及體液免疫的調(diào)控研究.pdf

1、橘小實蠅(Bactrocera dorsalis)是一種危害數(shù)百種果蔬的重要農(nóng)業(yè)害蟲，每年在中國乃至亞洲造成重大經(jīng)濟損失。RNAi是一種在真核生物中由dsRNA誘發(fā)的mRNA特異性降解的機制，由于其高效簡便等特點，廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)，醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)等方面的研究。雖然RNAi在真核生物中高度保守并且在農(nóng)業(yè)害蟲的研究中取得了長足發(fā)展，但將其應(yīng)用于實踐生產(chǎn)還存在許多問題待解決，例如在雙翅目果蠅中喂食法不能誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)以及在橘小實蠅中存在對R

2、NAi免疫耐受的現(xiàn)象。本研究探索了橘小實蠅對RNAi免疫耐受的分子調(diào)控機制，揭示了橘小實蠅中脂肪酸的生物合成與代謝通路在其對RNAi的免疫耐受反應(yīng)中起重要作用。并且證明了脂肪酸延伸酶對橘小實蠅的體液免疫通路也具有重要的調(diào)控作用。
　　1.已免疫橘小實蠅血淋巴能誘導(dǎo)未經(jīng)處理的橘小實蠅對RNAi的免疫耐受反應(yīng)。喂食橘小實蠅ds-rpl19，并確定成功誘導(dǎo)了RNAi免疫耐受反應(yīng)后，提取血淋巴注射并注射進未處理的橘小實蠅中。在注射已免疫組

3、血淋巴后喂食ds-rpl19的橘小實蠅中，目的基因未出現(xiàn)下調(diào)。而注射對照組血淋巴后再喂食dsRNA的橘小實蠅中則出現(xiàn)了顯著的RNAi效應(yīng)，靶標(biāo)基因的表達量減少了51％。同時，將血淋巴在25℃下分別處理1d、2d、3d或?qū)⒀馨鸵航?jīng)-20℃低溫處理后注射，均不會影響其對RNAi免疫耐受的誘導(dǎo)能力。而經(jīng)100℃高溫處理10 min后，血淋巴液喪失誘導(dǎo)RNAi免疫耐受反應(yīng)。注射經(jīng)高溫處理后的血淋巴液再喂食dsRNA，目的基因的表達量出現(xiàn)了48

4、％的下調(diào)。這些結(jié)果表明已對RNAi免疫耐受的橘小實蠅血淋巴中存在可能的“誘導(dǎo)因子”調(diào)控橘小實蠅的RNAi免疫耐受反應(yīng)，并且該“誘導(dǎo)因子”具有熱不穩(wěn)定性而在室溫下能較長時間保持誘導(dǎo)能力。
　　2.通過比較免疫組和對照組橘小實蠅血淋巴中各種化學(xué)組分的含量，發(fā)現(xiàn)免疫組橘小實蠅血淋巴中亞油酸:花生四烯酸的比例上升。通過免疫組和對照組橘小實蠅血淋巴代謝組學(xué)分析，我們一共鑒定出37種表達量有差異的代謝產(chǎn)物，其中17中代謝產(chǎn)物在免疫組血淋巴中含

5、量顯著升高，另外20種在對照組血淋巴中含量較高。在所有鑒定出的代謝產(chǎn)物中，含有14種磷脂和11種不同鏈長及飽和程度的脂肪酸，差異代謝產(chǎn)物中脂質(zhì)所占比例達到了67.57％。進一步分析代謝組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在免疫組橘小實蠅血淋巴中亞油酸:花生四烯酸的比值為11.5∶1，顯著高于對照組中的9.8∶1，表明花生四烯酸的含量相對減少了。我們將免疫組血淋巴中含量較高的物質(zhì)分別注射進未經(jīng)處理的橘小實蠅中并喂食dsRNA，發(fā)現(xiàn)注射亞油酸后可以誘導(dǎo)橘小實蠅對

6、RNAi的免疫耐受反應(yīng)。注射濃度為100μM和200μM的亞油酸后喂食dsRNA完全不能引起目的基因的下調(diào);注射濃度為50μM的亞油酸后再喂食dsRNA，導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)30％，而注射DMSO的對照組中目的基因表達量降低了55％，與注射50μM亞油酸的處理組間存在顯著差異。這些結(jié)果表明亞油酸在橘小實蠅中誘導(dǎo)的RNAi免疫耐受反應(yīng)隨注射濃度的降低而減弱。注射200μM亞油酸后，橘小實蠅對RNAi的阻礙效果可以持續(xù)48 h。同時我們

7、檢測了注射200μM亞油酸后橘小實蠅中胞吞相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)bet3、pi3k、ninac、vha16-1、vha-sfd、arf72a和ap50等基因出現(xiàn)了25％-65％的下調(diào)。免疫熒光染色的結(jié)果也顯示，注射亞油酸導(dǎo)致dsRNA分子不能正常通過胞吞作用進入橘小實蠅腸道細(xì)胞中。我們在已免疫橘小實蠅中注射濃度為50μM、100μM以及200μM花生四烯酸再喂食dsRNA，結(jié)果顯示靶標(biāo)基因分別下調(diào)了50％、67％和46％。同時在已免疫橘小

8、實蠅中，注射200μM花生四烯酸后胞吞相關(guān)基因的表達，如chc、rab7、arf72a、ap50和vha-sfd，也較注射DMSO的對照組中均出現(xiàn)了40％-57％的上調(diào)。之前的研究表明果蠅中喂食dsRNA不能誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)，根據(jù)上面的結(jié)果，我們將花生四烯酸注射進果蠅然后喂食dsRNA，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因下調(diào)了44％。免疫熒光染色的結(jié)果也表明注射花生四烯酸后，dsRNA分子能順利進入果蠅腸道細(xì)胞內(nèi)。
　　3.轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的研究發(fā)現(xiàn)脂肪

9、酸合成代謝通路在橘小實蠅RNAi免疫耐受中起重要的調(diào)控作用。我們分別將對照組和免疫組橘小實蠅的早期和晚期樣本進行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析，篩選差異表達的基因和蛋白。早期樣本中免疫組相較于對照組共有1204個基因和72個蛋白表達量上調(diào)，1343個基因和43個蛋白的表達量下調(diào);晚期樣本中免疫組相較于對照組有844個基因和68個蛋白表達上調(diào)，1119個基因和79個蛋白表達下調(diào)。對測序得到的差異表達基因和蛋白的結(jié)果進行GO富集分析結(jié)果表明在生物學(xué)過

10、程分類中，早期差異表達的基因和蛋白富集到了265個GO條目，分為14簇，包括生長發(fā)育、大分子代謝以及脂肪酸代謝等生物學(xué)過程;晚期樣本的差異表達基因和蛋白富集到了132個GO條目，分為12簇，包括磷脂代謝，跨膜運輸，含氮化合物代謝等生物學(xué)過程。結(jié)合代謝組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成與代謝通路對橘小實蠅RNAi免疫耐受起重要的調(diào)控作用。選取了該通路上的關(guān)鍵基因fasn，利用“RNAi of RNAi”的方法檢測該基因在橘小實蠅對RN

11、Ai的免疫耐受中的作用。干擾fasn后喂食ds-rpl19，并于5d后第二次喂食dsRNA，結(jié)果顯示，fasn干擾組目的基因表達量下調(diào)了50％，而對照組則在第二次喂食dsRNA后未出現(xiàn)明顯的RNAi效應(yīng)。
　　4.脂肪酸合成代謝通路上編碼脂肪酸延伸酶ELOVL6的關(guān)鍵基因noa調(diào)控橘小實蠅體液免疫通路的啟動。克隆得到的橘小實蠅noa基因全長1608 bp，包括990bp的開放閱讀框，編碼包含329個氨基酸的蛋白。表達模式的研究結(jié)果

12、表明noa基因在各個發(fā)育時期均有表達，其中胚胎期表達最高;在檢測的不同組織中，noa在精巢中的相對表達量最高，其次是卵巢。利用RNAi干擾noa基因的表達后，檢測到Toll通路上的MyD88和defensin分別在喂食ds-noa后第2d和第4d出現(xiàn)最大50％和74％的下調(diào);Imd通路上的realish和diptericin的表達在noa干擾后第2 d出現(xiàn)最大分別為63％和65％的下調(diào)。并且單增李斯特菌(Listeriamonocyto

13、genes)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)感染橘小實蠅后，noa基因的表達量會出現(xiàn)上調(diào)。喂食ds-noa后分別注射L.monocytogenes和S.aureus，MyD88和defensin在注射菌液后6h、12h和24 h的表達均較喂食ds-egfp再注射菌液的對照組有顯著下調(diào)。而干擾noa之后注射L.monocytogenes和E.coli，realish和