川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后微血管及膠原成分的影響.pdf

1、研究背景：
　　急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指脊髓遭受到外力打擊后導(dǎo)致完全性或不完全性脊髓運(yùn)動(dòng)、感覺、括約肌等功能障礙，是脊柱外科領(lǐng)域一種常見的且破壞性極大的疾病。至今仍缺乏有效的治療措施，探索有效的治療藥物一直是急性脊髓損傷研究的熱點(diǎn)。研究表明，局部微循環(huán)障礙是急性脊髓損傷后脊髓繼發(fā)性損傷加劇的重要原因，改善微循環(huán)對(duì)于促進(jìn)脊髓創(chuàng)傷后修復(fù)具有重要意義。川芎嗪（Tetramethylpyrazine

2、，TMP）是一種從中藥川芎中提取的生物活性單體，具有積極的抗缺血作用。本課題組長(zhǎng)期研究川芎嗪對(duì)急性脊髓損傷的保護(hù)作用，并通過大鼠急性脊髓挫傷模型發(fā)現(xiàn)其有改善微循環(huán)、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等作用。本實(shí)驗(yàn)同樣以大鼠急性脊髓挫傷模型為基礎(chǔ)，觀察川芎嗪對(duì)微血管的主要組分血管內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅳ型膠原和層連蛋白及對(duì)血管再生具有調(diào)節(jié)作用的Ⅰ型膠原和(ⅩⅧ)型膠原和對(duì)Ⅳ型膠原有裂解作用的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)

3、MMP-2和MMP-9的表達(dá)影響，以期進(jìn)一步了解川芎嗪對(duì)急性脊髓損傷后的微血管保護(hù)機(jī)制。
　　第一章：川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和微血管密度的影響
　　目的：
　　觀察川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和微血管密度的影響。
　　方法：
　　SD雄性大鼠共130只，其中10只大鼠只行椎板減壓術(shù)，不予脊髓打擊作為正常對(duì)照組(Sham組)，其余60只大鼠以改良Allen's打擊法制作不完全

4、性急性脊髓挫傷模型，隨機(jī)分為川芎嗪治療TMP組(n=30)和生理鹽水治療NS組(n=30)。TMP組大鼠于術(shù)后30分鐘至術(shù)后5天予以鹽酸川芎嗪腹腔注射治療(200mg/kg，Qdx5天)（1、3天組分別給藥至處死前）;NS組大鼠予以等量生理鹽水作相同干預(yù)，給藥時(shí)間、劑量和頻次同TMP組。每組(n=60)脊髓損傷大鼠分別用于免疫熒光檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、HE染色和免疫組化檢測(cè)微血管密度。用于檢測(cè)的大鼠分別于術(shù)后1、3、7、14、21和28

5、天共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)被處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死大鼠分別為n=10只，收取損傷段脊髓標(biāo)本。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于計(jì)數(shù)資料的同一時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1)HE染色示損傷后脊髓內(nèi)先后存在廣泛出血、血腫形成、血腫吸收、膠原細(xì)胞增生、瘢痕形成等病理進(jìn)程。
　　(2) TMP組和NS組均在損傷后1天即出現(xiàn)凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但NS組在3天時(shí)

6、凋亡血管內(nèi)皮細(xì)胞個(gè)數(shù)至峰值，14天之后凋亡細(xì)胞消失;TMP組在1天時(shí)凋亡血管內(nèi)皮細(xì)胞個(gè)數(shù)最多，隨后即下降，7天之后即消失。在3天、7天、14天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡百分比TMP組均顯著明顯少于NS組(P＜0.05)。
　　(3)TMP組和NS組均在損傷后1天時(shí)微血管密度明顯減少，隨后逐漸增高，至14天之后均繼續(xù)無明顯增長(zhǎng)，但損傷后個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞較Sham組排列均顯紊亂。在3天、7天、14天TMP組微血管密度均顯著大于N

7、S組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)川芎嗪可抑制急性脊髓損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　(2)川芎嗪可顯著提高急性脊髓損傷后的微血管密度。
　　第二章：川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后膠原成分和層連蛋白的影響
　　目的：
　　觀察川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后Ⅳ型膠原、層連蛋白、Ⅰ型膠原和(ⅩⅧ)型膠原表達(dá)影響。
　　方法：
　　SD雄性大鼠共65只，其中5只大鼠只行椎板減壓術(shù)，不予脊髓打

8、擊作為正常對(duì)照組(Sham組)，其余60只大鼠以改良Allen's打擊法制作不完全性急性脊髓挫傷模型，隨機(jī)分為川芎嗪治療TMP組(n=30)和生理鹽水治療NS組(n=30)。TMP組大鼠于術(shù)后30分鐘至術(shù)后5天予以川芎嗪腹腔注射治療(200mg/kg，Qdx5天)（1、3天組分別給藥至處死前）;NS組大鼠予以等量生理鹽水作相同干預(yù)，給藥時(shí)間、劑量和頻次同TMP組。脊髓損傷大鼠用于免疫組化檢測(cè)Ⅳ型膠原、層連蛋白、Ⅰ型膠原和(ⅩⅧ)型膠原。

9、大鼠分別于術(shù)后1、3、7、14、21和28天共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)被處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死大鼠分別為n=5只，收取損傷段脊髓標(biāo)本。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于計(jì)數(shù)資料的同一時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1) TMP組和NS組均在損傷后1天即出現(xiàn)Ⅳ型膠原陽(yáng)性表達(dá)增多，其表達(dá)來源除了血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還有神經(jīng)元、單核細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等，在基質(zhì)中也有彌散分布。

10、損傷1天后，兩組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目逐漸上升，均在7天時(shí)達(dá)到峰值隨后逐漸下降。TMP組在1天、3天、7天、14天的Ⅳ型膠原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著大于NS組(P＜0.05)。
　　(2) TMP組和NS組均在損傷后1天即出現(xiàn)層連蛋白陽(yáng)性表達(dá)增多，其表達(dá)來源除了原血管內(nèi)皮細(xì)胞外，在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)，其中神經(jīng)元胞質(zhì)表達(dá)最為明顯。損傷1天之后，兩組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目逐漸上升，均在7天時(shí)達(dá)到峰值隨后逐漸下降。TMP組在3天和7天層連蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)

11、胞數(shù)目顯著大于NS組（P＜0.05）。
　　(3) TMP組和NS組均在損傷后1天即出現(xiàn)Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在損傷后7天時(shí)達(dá)到峰值隨后逐漸下降。表達(dá)部位主要為神經(jīng)元和單核細(xì)胞。在3天、7天、14天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)TMP組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)均顯著大于NS組(P＜0.05)。
　　(4)NS組在損傷后7天開始出現(xiàn)(ⅩⅧ)型膠原陽(yáng)性表達(dá)，最初表達(dá)部位為單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨后神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多至21天達(dá)到峰

12、值，隨后下降;而TMP組在14天時(shí)才出現(xiàn)(ⅩⅧ)型膠原陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)部位同NS組，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目逐漸升高至28天到峰值。在7天、14天、21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)TMP組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著小于NS組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)川芎嗪可促進(jìn)脊髓損傷后早期的Ⅳ型膠原、層連蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)。
　　(2)川芎嗪可降低脊髓損傷(ⅩⅧ)型膠原的表達(dá)。
　　第三章：川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

13、
　　目的：
　　觀察川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響。
　　方法：
　　SD雄性大鼠共130只，其中10只大鼠只行椎板減壓術(shù)，不予脊髓打擊作為正常對(duì)照組(Sham組)，其余120只大鼠以改良Allen's打擊法制作不完全性急性脊髓挫傷模型，隨機(jī)分為川芎嗪治療TMP組(n=60)和生理鹽水治療NS組(n=60)。TMP組大鼠于術(shù)后30分鐘至術(shù)后5天予以鹽酸川芎嗪腹腔注射治療(200mg/

14、kg，Qdx5天)（1、3天組分別給藥至處死前）;NS組大鼠予以等量生理鹽水作相同干預(yù)，給藥時(shí)間、劑量和頻次同TMP組。每組(n=60) SCI大鼠分別用于免疫組化檢測(cè)MMP-2、MMP-9表達(dá)分布(IHC，n=30)和蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平(IF, n=30)。用于不同檢測(cè)目的大鼠分別于術(shù)后1、3、7、14、21和28天共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)被處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠分別為n=20

15、只，收取損傷段脊髓標(biāo)本。利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)計(jì)量資料的同一時(shí)間點(diǎn)的組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)于計(jì)數(shù)資料的同一時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1)免疫組化發(fā)現(xiàn)，TMP組和NS組均在損傷后1天即有MMP-2陽(yáng)性表達(dá)并逐漸上升，表達(dá)部位在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞。兩組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)在3天時(shí)均達(dá)到峰值隨后逐漸下降。T

16、MP組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)在1天、3天、7天和14天顯著小于NS組（P＜0.05）。
　　(2)運(yùn)用Western blot法檢測(cè)脊髓組織中MMP-2蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，損傷發(fā)生1天后MMP-2即有明顯表達(dá)增加，并逐漸上升，在3天時(shí)到達(dá)峰值隨后下降。在1天、3天、7天和14天TMP組表達(dá)明顯小于NS組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　(3)免疫組化發(fā)現(xiàn)，TMP組和NS組均在損傷后1天即有MMP-9陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)部位也在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)

17、胞、單核細(xì)胞。兩組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)均在1天時(shí)最多，隨后即下降。TMP組在1天、3天、7天、14天和21天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著小于NS組(P＜0.05)。
　　(4)運(yùn)用Western blot法檢測(cè)脊髓組織中MMP-9蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，損傷發(fā)生1天后MMP-9即有明顯表達(dá)增加，隨后逐漸下降。在1天、3天、7天、14天和21天TMP組表達(dá)明顯小于NS組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　川芎嗪可以減少脊髓損傷后的MMP