泛素特異性蛋白酶USP13的分子克隆和表達.pdf

1、目的：蛋白質的泛素化修飾是細胞內的一種基本調控機制，參與調控細胞循環(huán)，DNA修復，信號轉導和轉錄活化等多種細胞進程。這種轉錄后修飾是一種動態(tài)的、可逆的過程，由多種泛素結合酶和去泛素化酶調節(jié)控制。其中去泛素化酶可以特異性的去除泛素化蛋白底物上的泛素分子，從而調控細胞進程。
　　 去泛素化酶家族大約有95個成員，按結構和功能分為五種類型，包括泛素羧基末端水解酶(UCHs)，泛素特異性蛋白酶(USPs)，含Machado-Joseph

2、結構域的蛋白酶(MJDs)，卵巢腫瘤蛋白酶(OTUs)和JAMM Motif蛋白酶。USPs是去泛素酶家族中種類最多，結構最為復雜的一類，人類有54種USPs，它們的氨基酸序列都含有高度保守的結構域：Cys，His和Asp/Asn結構域。
　　 本課題所研究的泛素特異性蛋白酶13(USP13)屬于USPs家族，但對于USP13的功能活性和組織分布等都還沒有詳盡的研究報道。本研究通過對大鼠腦組織和人類TE-1食管癌細胞株usp13

3、基因的克隆，了解usp13在大鼠不同組織中的分布情況，建立去泛素化酶檢測體系，尋求檢測USP13去泛素化活性的最佳方法，為進一步研究USP13的活性和生物學功能奠定基礎。
　　 方法：
　　 (1)運用分子克隆的方法克隆usp13基因。采用TRNzol裂解法提取大鼠腦組織總RNA，采用分段擴增的方法，運用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分別擴增獲得usp13-5'和usp13-3’。將usp13基因5’和3’分別克隆

4、至pGEM-T easy載體，通過藍白斑篩選實驗確定陽性克隆并應用堿裂解法提取質粒，進行雙酶切鑒定及測序分析。
　　 (2)采用熒光定量PCR(Real-Time RT-PCR)2-ΔΔCt相對定量方法檢測usp13在大鼠腦組織、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、骨骼肌、脾臟和睪丸中的相對表達水平。以GAPDH基因作為內參，將標本間RNA的質量和逆轉錄效率的差異進行標準化。以usp13在腦組織中的表達水平作為校準樣本，比較各組織中usp1

5、3表達水平的差異。
　　 (3)GST-USP13融合蛋白的表達首先將usp13-5’基因克隆到pGEX6p-1原核表達載體，得到pGEX-usp13-5'質粒，然后將usp13-3’基因克隆到pGEX-usp13-5’質粒中，最終得到pGEX-usp13質粒。在大腸桿菌DH5α中表達，獲得120kDa左右的GST-USP13融合蛋白，同時檢測融合蛋白GST-USP13的可溶性。
　　 (4)構建兩種去泛素化酶活性檢測體

6、系，檢測大鼠USP13去泛素化酶活性。①T7-USP13/GST-Ub52方法采用定向克隆的方法構建pAC-T7-usp13質粒，可表達帶有T7標簽的T7-USP13蛋白。pAC-T7-usp13表達質粒與標準底物(GST-Ub52)表達質粒pGEX-Ub52共轉化BL21感受態(tài)細胞，經IPTG誘導后共表達，研究去泛素化酶的活性。以GST-Ub52做為標準底物，分子量為45kDa，去泛素化后分子量為36kDa。以去泛素化酶USP46作為

7、陽性對照。用GSH-Sepharose-TM Resin純化蛋白系統(tǒng)純化GST融合蛋白，進行10％SDS-PAGE電泳檢測。②GST-USP/Ub-Met-β-gal方法以GST-USP13融合蛋白的表達質粒pGEX-usp13和表達Ub-Met-β-gal融合蛋白底物的pAC-M-β-gal質粒共轉化BL21感受態(tài)細胞，經IPTG誘導后共表達，用anti-β-gal抗體進行蛋白印記分析。以USP46作為陽性對照，用Odyssey紅外熒

8、光掃描成像系統(tǒng)進行分析。
　　 (5)運用分子克隆的方法從人類TE-1食管癌細胞株中克隆usp13基因，采用去泛素化酶活性檢測系統(tǒng)檢測人類USP13去泛素化酶活性。
　　 結果：
　　 (1)本課題從大鼠腦組織中成功克隆出泛素特異性蛋白酶usp13基因。大鼠usp13基因的編碼區(qū)由2，577個堿基組成，編碼858個氨基酸，推測其相對分子質量約為96kDa。USP13包含高度保守的結構域：Cys，His和Asp區(qū)域

9、，符合泛素特異性蛋白酶的特征。
　　 (2)usp13在大鼠腦組織、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、骨骼肌、脾臟和睪丸中均有表達，其中肺臟和腎臟中的表達量略高于腦組織中的表達量，分別是腦組織中表達量的1.17和1.13倍；心臟、肝臟和脾臟中表達水平與腦組織相近，分別是其1.04、1.02和0.91倍；而在睪丸和骨骼肌中表達較少，僅為腦組織中的0.55、0.36倍。
　　 (3)表達出GST-USP13融合蛋白。含重組質粒pGEX

10、-usp13的大腸桿菌DH5α經IPTG誘導，出現(xiàn)一種分子量約為120kDa的新蛋白表達，與GST（分子量為26kDa）和USP13（分子量約為96kDa）的理論分子量相符，并且37℃誘導4小時該融合蛋白為不溶性蛋白，在15℃經TPTG誘導40小時，GST-USP13融合蛋白部分可以溶解。
　　 (4)建立兩種去泛素化酶活性檢測體系，可以成功檢測到作為陽性對照的USP46的去泛素化酶活性，也可以檢測到USP13和特異性底物的表達

11、，但對于檢測USP13的去泛素化酶活性，兩種體系均不理想。
　　 (5)從人類TE-1食管癌細胞株中克隆出usp13基因，人類usp13的編碼區(qū)由2，592個堿基組成，編碼863個氨基酸，推測其相對分子質量約為97kDa。并且兩種去泛素化酶活性檢測體系對于檢測人類USP13的去泛素化酶活性同樣未得到理想結果。
　　 結論：
　　 (1)克隆出大鼠泛素特異性蛋白酶usp13基因(GenBank accessionn