利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造油菜脂肪酸變異新資源.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物之一。進(jìn)一步提高油酸含量適當(dāng)降低亞麻酸含量是油菜品質(zhì)改良的重要內(nèi)容，而獲得高油酸和低亞麻酸資源是開展育種工作的基礎(chǔ)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)控制油菜種子中油酸含量的FAD2及亞麻酸含量的FAD3基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并通過對(duì)轉(zhuǎn)基因后代的連續(xù)自交和回交，獲得了不帶有轉(zhuǎn)基因元件的高油酸低亞麻酸突變體。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)甘藍(lán)型油菜FAD2與FAD3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用在線軟件篩選出

2、基因編輯靶點(diǎn)，構(gòu)建了對(duì)油菜FAD2與FAD3基因靶點(diǎn)特異的CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜品系J9707，獲得了143株轉(zhuǎn)FAD2靶基因和169株轉(zhuǎn)FAD3靶基因轉(zhuǎn)基因油菜。
　　2.通過非變性PAGE膠檢測(cè)了所有的轉(zhuǎn)基因陽性植株，并挑選出部分突變單株進(jìn)行了測(cè)序分析。本研究對(duì)FAD2靶基因的編輯效率為16％，而對(duì)FAD3的編輯效率為5％。FAD2突變體測(cè)序與靶基因核酸序列比對(duì)表明，單個(gè)堿基插

3、入是主要的突變類型，占到各種突變類型的50％以上，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有2個(gè)至13個(gè)堿基缺失的多種突變類型。部分FAD3突變體測(cè)序結(jié)果檢測(cè)到G-A堿基的替換和2個(gè)堿基AC的插入的突變。
　　3.對(duì)FAD2基因在2個(gè)靶點(diǎn)各個(gè)拷貝突變效率進(jìn)行了比較分析。針對(duì)第一個(gè)靶位點(diǎn)，BnaA.FAD2.a與BnaC.FAD2.a拷貝的突變效率為分別為53％和29％;而BnaA.FAD2.b與BnaC.FAD2.b拷貝雖然只在靶標(biāo)序列的第一個(gè)堿基處有差異，前

4、者的突變率為18％，BnaC.FAD2.b拷貝未檢測(cè)到突變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PAM序列對(duì)突變效率有較大影響。在第二個(gè)靶點(diǎn)位置，BnaA.FAD2.α拷貝的PAM序列為-GGG，突變效率為71％，然而PAM序列為-NGA的其他拷貝均未出現(xiàn)突變。
　　4.突變單株自交及雜交后代基因型分析表明，雜合突變單株后代基因型的分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。本研究在T0代沒有編輯的陽性單株后代株系中檢測(cè)到了突變單株，也觀測(cè)到有些在T0代葉片中檢測(cè)到突變