結核分枝桿菌Cas2(Rv2816c)在脅迫應答及胞內存活中的作用與分子機理.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種嚴重威脅人類健康的疾病，它仍然是中國乃至世界上威脅人類健康的重要傳染病。世界人口中大約有1/3是結核分枝桿菌的潛伏感染者，每年死于結核病的人大約有130萬[1]。導致結核病難以攻克的主要原因是多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)以及與HIV共感染。因此，需要對結核病的致病菌——結核分枝桿菌進行更加深入的基礎研究。
　　結核分枝桿菌在體外生長

2、的過程中面臨著病毒——噬菌體的威脅，噬菌體在地球上幾乎無處不在。面對噬菌體的威脅，細菌逐漸進化出了一系列的抗噬菌體機制，例如:限制性內切酶、流產感染[2]，以及clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat(CRISPR)系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)是一個最近幾年發(fā)現(xiàn)的細菌抗噬菌體機制，它存在于90％的古生菌以及40％的細菌基因組中[3，4]，它為細菌和古生菌提供了一套獲得性噬菌

3、體抵抗機制。CRISPR系統(tǒng)含有由一系列被非重復的間隔序列分散的短的重復序列。此外，它還包含一個前導序列和周圍CRISPR-相關的基因(CAS)[5]。不同的Cas蛋白的功能各不相同，例如核糖核酸酶、解旋酶、聚合酶等。最近有研究證明，CRISPR位點具有基因表達調控的功能[6]。Francisellanovicida的Cas9蛋白能夠調控編碼脂蛋白的基因FTN1103的表達[7]。CRISPR中與自身基因組中的DNA序列同源的間區(qū)被報道

4、與自身免疫及基因表達調控有關[8，9]。
　　Cas2已經被報道是一個在間區(qū)獲得過程中起重要作用的保守的RNA核酸內切酶[10-12]，它廣泛分布于所有含有CRISPR序列的微生物基因組中[9，13，14]。Cas2對于L.pneumophila侵染其宿主Hartmannella和Acanthamoeba以及逃避巨噬細胞免疫非常重要[15]。結核分枝桿菌基因組中具有兩個串聯(lián)的CRISPR結構，并且它們周圍有9個編碼CRISPR相關

5、的蛋白的基因，其中包括編碼Cas2的Rv2816c[12]。當用抑制代謝的抑制劑，例如抗生素、引起壓力的試劑等處理結核分枝桿菌后，Rv2816c的轉錄水平會發(fā)生變化[16]。因此我們推測Rv2816c可能涉及到結核分枝桿菌的抗壓力反應以及抗生素抗性。
　　本文通過將分枝桿菌Cas2的氨基酸序列與之前研究過的硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的Cas2氨基酸序列進行比對，找到分枝桿菌Cas2的二級結構元件以及它

6、的催化活性位點，且發(fā)現(xiàn)Cas2在致病分枝桿菌中是非常保守的。我們用恥垢分枝桿菌作為模式菌株構建了過表達結核分枝桿菌Cas2(Rv2816c)的重組恥垢分枝桿菌M.smegmatis-pALACE-Rv2816c。對M.smegmatis-pALACE-Rv2816c表型進行了觀察，并研究了Cas2對恥垢分枝桿菌胞外壓力反應以及在巨噬細胞內存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)Cas2的表達改變了恥垢分枝桿菌的生長速率、單菌落形態(tài)、滑動能力以及生物膜的形

7、成能力，這些表面形態(tài)的改變可能與Cas2引起的恥垢分枝桿菌細胞壁脂質成分的改變有關;此外，我們發(fā)現(xiàn)了Cas2引起的恥垢分枝桿菌壓力反應的改變與SigB、SigE及SigH表達水平的改變有關。這三個Sigma因子涉及到分枝桿菌的壓力反應以及毒力。我們還發(fā)現(xiàn)Cas2降低了M.smegmatis-pALACE-Rv2816c在巨噬細胞中的存活率，并伴隨著宿主細胞因子IL-6和IL-10的轉錄水平降低。我們的工作為Cas2功能的研究提供了新的方