協(xié)同刺激分子B7-H3在人結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)制及臨床意義.pdf

1、正常細(xì)胞與其周圍的組織環(huán)境之間存在動(dòng)態(tài)平衡，兩者共同作用可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞表面相關(guān)因子的分泌和表達(dá)。在腫瘤發(fā)生惡變的過(guò)程中，這一平衡遭到破壞。腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，就需要不停地建立適于自己生長(zhǎng)的外部組織環(huán)境，此即腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中，存在著正性和負(fù)性免疫成分，包括巨噬細(xì)胞Mφ粒細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞(Tc)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、失能狀態(tài)T細(xì)胞(AnergicTcell)等。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的不同階段，由于微環(huán)境中免疫

2、細(xì)胞亞群數(shù)量和功能的改變，以及產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子和介導(dǎo)不同的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)從免疫監(jiān)視功能對(duì)腫瘤耐受，并呈現(xiàn)共生存，最后促形成腫瘤免疫逃逸。
　　 “協(xié)同刺激信號(hào)”是1970年由Bretscher和Cohn在T細(xì)胞活化雙信號(hào)模型的基礎(chǔ)上提出的，隨著研究的不斷深入，介導(dǎo)協(xié)同刺激信號(hào)的協(xié)同刺激分子已成為免疫學(xué)研究新的熱點(diǎn)之一。近年，一些協(xié)同刺激分子被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中異常表達(dá)。腫瘤細(xì)胞協(xié)同刺激分子的表達(dá)改變，包括正性協(xié)同刺激分子

3、表達(dá)的下降以及負(fù)性協(xié)同刺激分子表達(dá)的增高，參與了腫瘤免疫逃逸、腫瘤轉(zhuǎn)移與遷徙等過(guò)程，是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要因素。
　　 B7-H3是2001年從人DC的cDNA庫(kù)中克隆得到的B7家族的一個(gè)成員。人B7-H3基因定位于15q24，屬免疫球蛋白家族的I型跨膜蛋白。人B7-H3mRNA在人類組織中廣泛表達(dá)，而蛋白在正常組織幾乎不表達(dá)。鼠和人B7-H3都具有包括一個(gè)IgV樣和一個(gè)IgC樣的雙區(qū)域結(jié)構(gòu)(2IgB7-H3)，而人和其他靈長(zhǎng)類

4、動(dòng)物證實(shí)還具有IgV-IgC-IgV-IgC(4IgB7-H3)的四區(qū)域結(jié)構(gòu)。最初的研究表明B7-H3能刺激CD4+T細(xì)胞的增殖，使CTL活性增加，同時(shí)提高IFN-γ的分泌和表達(dá)，被認(rèn)為是一正性協(xié)同刺激分子。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3信號(hào)可負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的活化及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，因此認(rèn)為B7-H3可能是一負(fù)性協(xié)同刺激分子。由于B7-H3的受體目前尚未確認(rèn)，使得對(duì)其功能的研究難以深入開(kāi)展。業(yè)已表明，B7-H3蛋白在諸多腫瘤組織中高表達(dá)，呈

5、現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面及胞漿里，在腫瘤血管也有表達(dá)，尤為有意義的是異常表達(dá)的B7-H3分子與腫瘤的臨床病理因素和預(yù)后相關(guān)，顯示其在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的重要作用。目前，對(duì)于B7-H3分子在腫瘤組織中異常表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，以及B7-H3分子如何參與腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制尚待研究。
　　 第一部分協(xié)同刺激分子B7-H3在人結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義
　　 【目的】檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織中協(xié)同刺激分子B7-H3的表達(dá)，分析其表達(dá)與腸癌臨床病理因

6、素及患者生存時(shí)間的關(guān)系，探討B(tài)7-H3的表達(dá)在腸癌演進(jìn)過(guò)程中的意義。
　　 【方法】收集腸癌手術(shù)切除的組織219例，統(tǒng)計(jì)患者的病理資料及生存時(shí)間；分別收集腸癌演進(jìn)過(guò)程中的各階段病變組織，包括息肉、腺瘤、高級(jí)別瘤變和腸癌組織。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法，分析B7-H3分子在腸癌組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)的意義。
　　 【結(jié)果】免疫組化結(jié)果顯示，219例結(jié)直腸癌患者中，99例患者組織低表達(dá)B7-H3分子，占45.2％；12

7、0例患者組織高表達(dá)B7-H3分子，占54.8％。B7-H3在腸癌組織的表達(dá)水平與患者性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及是否粘液腺癌無(wú)顯著相關(guān)性；而與患者的年齡、腫瘤大小、分化程度以及腫瘤的分期密切相關(guān)。生存分析顯示B7-H3表達(dá)水平與腸癌患者生存率的相關(guān)性雖無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但40個(gè)月后的生存情況顯示了B7-H3低表達(dá)患者的生存率高于B7-H3高表達(dá)患者的趨勢(shì)。進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)B7-H3在腺瘤階段就呈現(xiàn)表達(dá)，而后高表達(dá)在高級(jí)別瘤變及腸

8、癌組織中，B7家族其他負(fù)性分子B7-H1、B7-H4則僅局限在腸癌組織中表達(dá)。
　　 【結(jié)論】協(xié)同刺激分子B7-H3在腸癌組織中異常高表達(dá)，并與腸癌的分期和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)；B7-H3在結(jié)直腸演變?cè)缙陔A段即表達(dá)，是B7家族負(fù)性分子中最早參與腸癌事件發(fā)生的分子，這些均提示B7-H3分子參與了腸癌演進(jìn)的整個(gè)過(guò)程并發(fā)揮重要的作用。
　　 第二部分可溶性B7-H3分子在腸癌患者外周表達(dá)的臨床意義及產(chǎn)生機(jī)制
　　 【目的】

9、檢測(cè)可溶性B7-H3分子在腸癌患者外周血的表達(dá)，分析其臨床意義；探討B(tài)7-H3在腸癌細(xì)胞異常表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制及可溶性B7-H3分子的產(chǎn)生機(jī)制。
　　 【方法】收集腸癌患者術(shù)前外周血標(biāo)本56例和健康人外周血60例，統(tǒng)計(jì)患者病理資料。采用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法測(cè)定可溶性B7-H3分子在正常人及腸癌患者外周的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其臨床意義。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸癌細(xì)胞株B7-H3分子的表達(dá)，采用細(xì)胞因子TNF-a、IFN-γ體外作用腸癌細(xì)胞后，使用流式細(xì)

10、胞術(shù)、酶聯(lián)免疫標(biāo)記及PT-PCR方法分析其膜型和可溶性B7-H3及B7-H3mRNA表達(dá)的改變，以及RT-PCR分析腸癌細(xì)胞B7-H3分子兩種異構(gòu)體的表達(dá)和細(xì)胞因子對(duì)其調(diào)節(jié)作用；使用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)抑制可溶性B7-H3的表達(dá)。
　　 【結(jié)果】ELISA結(jié)果顯示，正常人外周血存在16.8±7.48ng/ml的可溶性B7-H3分子，腸癌患者外周血中可溶性B7-H3分子表達(dá)水平明顯升高（30.34±11.93ng/ml

11、）；可溶性B7-H3分子在腸癌外周血中的表達(dá)水平與腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；五株腸癌細(xì)胞株表面均存在不同程度的B7-H3分子的表達(dá)，TNF-a能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌可溶性B7-H3分子，上調(diào)2IgB7-H3mRNA的表達(dá)。腸癌細(xì)胞分泌可溶性B7-H3分子可被MMPI抑制。
　　 【結(jié)論】可溶性的B7-H3分子存在于腸癌患者外周血及正常人外周血中，腸癌患者外周可溶性B7-H3分子水平較正常人顯著增高。高表達(dá)的可溶性B7-

12、H3分子與腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，由此提示膜型和可溶性B7-H3分子在腸癌分別介導(dǎo)不同的作用，調(diào)控外周和局部的腫瘤微環(huán)境影響腫瘤的進(jìn)展。B7-H3的表達(dá)受到腸癌中重要的炎癥因子TNF-a的調(diào)節(jié)，TNF-a可促進(jìn)2IgB7-H3轉(zhuǎn)錄，上調(diào)可溶性B7-H3的表達(dá)，由此表明2IgB7-H3是可溶性B7-H3的主要來(lái)源。腸癌細(xì)胞分泌可溶性B7-H3分子主要由金屬蛋白酶切割B7-H3膜分子所產(chǎn)生。
　　 第三部分協(xié)同刺激分子B

13、7-H3對(duì)腸癌腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的作用機(jī)制
　　 【目的】研究腸癌微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)及臨床意義，分析B7-H3分子的異常表與浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的關(guān)系，探討B(tài)7-H3調(diào)控腫瘤免疫應(yīng)答的可能機(jī)制。
　　 【方法】通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析腸癌組織中浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其浸潤(rùn)與腸癌預(yù)后的關(guān)系；分析B7-H3的表達(dá)與腸癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系；采用然高表達(dá)B7-H3分子的腸癌細(xì)胞株CW-2細(xì)胞體外與單

14、核細(xì)胞共同培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)，酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌；使用B7-H3中和型抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，分析B7-H3信號(hào)的封閉對(duì)單核細(xì)胞分化成腫瘤巨噬細(xì)胞的作用；流式細(xì)胞術(shù)分析活化的單核細(xì)胞上B7-H3分子可能受體的表達(dá)。
　　 【結(jié)果】IHC染色顯示，在腸癌組織大量浸潤(rùn)著CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及CD68+TAM；CD3+T細(xì)胞在腸癌組織的浸潤(rùn)和腸癌患者的生存時(shí)間密切

15、相關(guān)，而CD8+T細(xì)胞在腸癌組織的浸潤(rùn)和腸癌患者的生存時(shí)間關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B7-H3的表達(dá)水平與CD3+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞在腸癌組織浸潤(rùn)的數(shù)量均無(wú)相關(guān)性；CD68+TAM在腸癌組織的浸潤(rùn)和腸癌患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，且B7-H3和在腸癌浸潤(rùn)的CD68+TAM細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。在腸癌細(xì)胞表面表達(dá)的B7-H3分子和腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的共同作用下，誘導(dǎo)的單核細(xì)胞表達(dá)低水平的MHC-Ⅱ分子(DR)和較高水平的MMR(CD206)，幾乎不表

16、達(dá)iNOS，分泌高水平的IL-10和TNF-a，表現(xiàn)出M2型巨噬細(xì)胞表型；經(jīng)B7-H3中和型抗體作用后，腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)DR和iNOS，下調(diào)表達(dá)MMR，同時(shí)IL-10和TNF-a的分泌部分受到抑制，由此表明腫瘤B7-H3分子是促進(jìn)單核細(xì)胞向腫瘤巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號(hào)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)LPS激發(fā)后，誘導(dǎo)的單核細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)與B7-H3融合蛋白結(jié)合的可能受體。
　　 【結(jié)論】本部分研究表明，浸潤(rùn)C(jī)D3+T細(xì)胞與腸癌

17、患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，再次證實(shí)T細(xì)胞應(yīng)答在腫瘤免疫中的重要作用，而CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的程度與腸癌患者的預(yù)后并無(wú)直接關(guān)系，表明了腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞的異質(zhì)性，可能其腫瘤微環(huán)境中處于失能狀態(tài)。B7-H3分子在腸癌腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)與T細(xì)胞浸潤(rùn)不相關(guān)，而與腫瘤巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量正相關(guān)，提示腫瘤B7-H3分子并非是通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞的浸潤(rùn)來(lái)參與腫瘤免疫的，而是腫瘤巨噬細(xì)胞。腫瘤B7-H3分子可以促進(jìn)單核細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中向M2型巨噬細(xì)胞的分

18、化，分泌抑制腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，阻斷B7-H3信號(hào)可以抑制M2型巨噬細(xì)胞的分化；B7-H3的可能受體被發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)在活化的單核細(xì)胞上，表明腫瘤性B7-H3信號(hào)可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的分化參與腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，這為B7-H3分子參與腫瘤免疫應(yīng)答的機(jī)制研究提出新的思路。
　　 綜上所述，本課題通過(guò)分析膜型和可溶型B7-H3分子在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其臨床意義，進(jìn)而探討了B7-H3分子在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)調(diào)控腫瘤巨噬細(xì)胞的分化進(jìn)而