殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對(duì)治療鼠整體免疫功能的影響.pdf

1、選擇性清除或抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞是治療移植排斥和自身免疫病等的理想策略之一，因?yàn)樗鼙苊饷庖咭种苿┧鶎?dǎo)致的患者整體免疫功能損傷。因此，幾十年來(lái)人們一直在探索各種特異性免疫療法，殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(Killer artificial antigenpresenting cell,KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使現(xiàn)有的抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)Fas配體，并通過(guò)細(xì)胞膜上的pMHC分子靶向結(jié)合抗原特異性T細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)

2、膜上的FasL與活化后T細(xì)胞膜上的Fas分子結(jié)合從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。這種策略對(duì)同種移植排斥、自身免疫病及變態(tài)反應(yīng)等的治療都有很多成功的報(bào)道。然而，殺傷性細(xì)胞療法同時(shí)也遭到強(qiáng)烈的質(zhì)疑:除了生物安全性和原代DC等細(xì)胞的大規(guī)模制備困難外，更重要的是FasL在載體細(xì)胞膜上的表達(dá)水平難以均勻的控制。為了避免細(xì)胞性療法的這些缺陷，近年來(lái)人們轉(zhuǎn)而關(guān)注以非細(xì)胞性物質(zhì)為載體，標(biāo)記pMHC多聚體和FasL，制備靶向殺傷性制劑。這種非細(xì)胞性的KaAPC在體內(nèi)

3、的靶向殺傷效應(yīng)仍少有報(bào)道。
　　本論文利用在人體內(nèi)可生物降解、有組織相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)共吸附H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗，制作以H-2kb分子為靶向抗原的KaAPCs，研究其治療小鼠皮膚移植排斥的效果及其對(duì)治療鼠整體免疫功能的影響。結(jié)果顯示:KaAPCs治療能明顯延長(zhǎng)皮膚移植物的存活期，治療鼠的整體免疫功能如抗腫瘤能力和對(duì)第三方供

4、體的同種反應(yīng)能力等也沒(méi)有明顯受損。主要結(jié)果如下:
　　1)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑4.5μm的PLGA微球。掃描電鏡、Zeta電位和粒徑分析顯示其具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整，61.2％的微球直徑在4.0-5.0μm，平均Zeta（ξ-）電位為36.3mV±6.11 mV，分散性好，表面氨基基團(tuán)豐富;BSA和單抗包被實(shí)驗(yàn)顯示其有良好的蛋白負(fù)載能力:對(duì)BSA的最大負(fù)載量為54.2μg/5×106 bea

5、ds;利用H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗共包被PLGA微球，成功制備以H-2Kb分子為靶向抗原的KaAPCs，單抗染色和流式分析證實(shí)有正確表型。
　　2)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為皮膚移植的供受體，在移植術(shù)后第5、7、9天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進(jìn)行分組治療，然后:在第12天取各組脾細(xì)胞，CFSE標(biāo)記后在體外與第三方KM

6、鼠的脾細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3天和7天，流式分析各組治療鼠CD3+T細(xì)胞群的同種增殖能力;皮膚移植術(shù)后第3天皮下注射SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，而后進(jìn)行分組治療，并每天測(cè)量腫瘤大小，第23天時(shí)殺鼠取腫瘤組織，稱(chēng)重，制冰凍切片后FITC-anti-mouse CD3單抗染色。結(jié)果顯示:KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)4.5-7天;治療鼠脾臟T細(xì)胞在體外對(duì)第三方小鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力無(wú)明顯降低;治療鼠載瘤實(shí)驗(yàn)的成瘤時(shí)間、

7、腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及腫瘤組織中CD3+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)等與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　3)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(H-2Kbm1)為皮膚移植的供受體。兩者的遺傳背景只有H-2Kb抗原上三個(gè)氨基酸的差異。這種移植模型將能最大限度地凸顯H-2Kb同種反應(yīng)性T細(xì)胞的清除或抑制對(duì)移植排斥的影響。在皮膚移植術(shù)后第7、9、11天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進(jìn)行分組治療，然后:

8、在移植術(shù)后第14天取各組脾細(xì)胞，CFSE標(biāo)記后，在體外與第三方BALB/c鼠的脾細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3天和7天，流式分析各組治療鼠CD3+T和CD8+T細(xì)胞群的同種反應(yīng)增殖能力;皮膚移植術(shù)后第3天皮下注射B16黑色素瘤細(xì)胞，而后分組治療，并每天測(cè)量腫瘤大小，第23天時(shí)殺鼠取腫瘤組織，稱(chēng)重，制冰凍切片后APC-anti-mouse CD3以及FITC-anti-mouse CD8單抗染色;在第11天選部分鼠取脾臟細(xì)胞用CFSE標(biāo)記，

9、與Yac-1淋巴瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)4-5h，后用7-AAD染色死亡細(xì)胞，流式分析NK細(xì)胞的殺瘤活性;在第9、11、13天各選部分鼠取脾臟細(xì)胞，用APC-anti-CD3、FITC-AnnexinⅤ和PI做三色熒光染色，流式分析各組CD3+T細(xì)胞群中凋亡T細(xì)胞的比例及脾臟中T細(xì)胞的頻率;在第9和13天各選部分鼠取眼眶周?chē)?，?jīng)血液分析儀行血常規(guī)分析。結(jié)果顯示:KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)24.3-27.3天;治療鼠中，

10、脾臟T細(xì)胞在體外對(duì)第三方小鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力無(wú)明顯降低:移植瘤的成瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及腫瘤組織中CD3+T和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)等與對(duì)照組無(wú)明顯差異;脾臟NK細(xì)胞的殺瘤能力亦無(wú)顯著下降;在第三次治療后（即第13天），脾臟T細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組，T細(xì)胞頻率則顯著低于對(duì)照組;在第三次治療后，外周血中性粒細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著降低，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量則無(wú)明顯下降。
　　4)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能

11、化的、直徑為450nm以及200nm的PLGA納米球，具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整;平均Zeta電位為36.2mV+5.00mV左右;共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗后制成兩種直徑的納米級(jí)KaAPC，經(jīng)PE-anti-H-2Kb單抗和FITC-anti-hamster IgG單抗免疫熒光染色分析證實(shí)其表型正確;在C57BL/6(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受對(duì)的皮膚移植模型中，直徑為450nm