bcl-2在抗鎘致大鼠原代近曲小管細胞凋亡中的作用.pdf

1、鎘(Cd)是重要的工業(yè)和環(huán)境污染物之一,可由食物鏈和飲用水進入人體,對機體腎、肝、肺、睪丸、骨骼及血液系統(tǒng)均可產生毒性,其中腎臟是其損害的主要靶器官。目前,國內對鎘誘導腎細胞凋亡的研究較少,而且其機制至今也尚未清楚。因此,本課題通過用攜帶bcl-2基因的重組腺病毒(由增強型綠色熒光蛋白EGFP標記)感染原代SD大鼠近曲小管細胞,研究Bcl-2蛋白在鎘致細胞凋亡中的作用及其機制。為進一步研究鎘對腎毒性的機理提供科學依據(jù)。
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2、 SD大鼠腎近曲小管細胞原代培養(yǎng)方法的建立
　　 本實驗采用三種分離方法對SD大鼠腎近曲小管細胞進行培養(yǎng)。它們分別是:機械研磨組織培養(yǎng)法(A法)、機械研磨加0.125％胰酶-0.02％EDTA消化法(B法)、機械研磨加1g/L的膠原酶Ⅰ消化法(C法)。含有10％的胎牛血清、5 ng/mL EGF、100 U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液,培養(yǎng)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱。
　　 通過對三種培養(yǎng)方

3、法的比較分析結果如下:A法,細胞36 h后始見有細胞從組織中伸出,細胞團塊較多,貼壁量少,貼壁率30％,細胞生長不良,體積大小不一;B法,細胞24 h左右貼壁生長,但貼壁生長量較少,貼壁率40％,細胞生長不整齊;C法,細胞于24 h左右即可見到貼壁生長,貼壁率70％,細胞基本能長滿培養(yǎng)板,形態(tài)為多邊形,體積較大,細胞團塊周圍生長出大量的細胞。經多次重復試驗發(fā)現(xiàn),C法是三種方法中最好的,細胞生長狀況和細胞產量均好于其他兩法。
　　

4、 2 bcl-2重組病毒滴度的測定及對原代近曲小管細胞的感染
　　 將攜帶bcl-2基因的重組腺病毒(EGFP標記)在HEK293細胞中擴增,收集病毒原液。將對數(shù)期生長的HEK293細胞以90μL/孔(1×105/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h。分15組,每組2孔。每組加10μL/孔病毒液,濃度分別是:1、1/10、1/102、1/1031/1013病毒原液,最后一組為空白對照。培養(yǎng)20 h后,在熒光倒置顯微鏡下觀察產

5、生綠色熒光的細胞數(shù)量,確定計量孔(熒光細胞數(shù)少于5個)為第9孔(計為1 U);根據(jù)公式10:1稀釋的病毒滴度=1 U×10n-1/0.01 mL=10n+1PFU/mL,計算得到病毒滴度為1010 PFU/mL。以不同感染復數(shù)(MOI,MOI=病毒滴度×加入的病毒體積/近曲小管細胞數(shù))的重組腺病毒感染原代近曲小管細胞。在熒光顯微鏡下觀察,24 h后MOI≥50感染的細胞有熒光,說明腺病毒成功感染腎近曲小管細胞。3鎘致原代細胞凋亡及腺病毒

6、介導的Bcl-2蛋白對其抑制作用的研究
　　 研究Bcl-2蛋白的抗鎘致原代腎近曲小管細胞凋亡的特性。用含有及不含有bcl-2基因的重組腺病毒感染SD大鼠原代腎近曲小管細胞(Proximal tubulecells,PTC)。即PTC+Ad-bcl-2-EGFP,PTC+Ad-EGFP,PTC三組,同時設定氯化鎘濃度梯度和作用時間梯度刺激細胞,經MTT檢測細胞增殖的變化、AO/EB雙染法測定細胞凋亡率的變化、DNA Ladder