LyGDI在腫瘤細胞輻射凋亡敏感性中的作用與P53調(diào)控研究.pdf

1、目的：構建1yGDI及AN191yGDI的帶有熒光標記的真核表達載體并分析外源性表達1yGDI及AN191yGDI對輻射誘導細胞凋亡和細胞放射敏感性的影響并分析其機制；研究恢復細胞P53蛋白表達對細胞輻射誘導凋亡及LyGDI的影響。 方法： 1.設計1yGDI及AN191yGDI基因上下游引物，PCR擴增基因片段，分別構建pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達載體。經(jīng)酶切、PCR、測序

2、驗證其正確性；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核細胞MCF-7后免疫印跡檢測融合蛋白的表達，免疫組化觀察融合蛋白在細胞內(nèi)定位； 2.脂質(zhì)體法以pcDNA3.1-wt p53轉(zhuǎn)染L929細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，RT-PCR、免疫印跡法驗證；生長曲線法檢測細胞增殖能力的的變化；X射線照射后，克隆法檢測放射敏感性的變化；流式細胞術檢測細胞凋亡率的改變，免疫印跡法檢測相關蛋白的表達； 3.利用構建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI基因

3、的L929、A549細胞。檢測轉(zhuǎn)染lyGDI對輻射誘導兩種細胞凋亡率的影響，探究其對細胞放射敏感性的影響，免疫印跡法檢測相關蛋白的表達。 結果：測序證明基因序列完全正確，免疫印跡和免疫熒光染色檢測到目的蛋白表達；恢復細胞P53蛋白的表達抑制了L929細胞的增殖能力，促進輻射誘導的細胞凋亡并誘導LyGDI斷裂；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI的L929細胞輻射誘導的凋亡率上升，輻射處理后觀察到融合蛋白斷裂成相對應的LyGDI

4、及AN19LyGDI蛋白；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI的A549細胞輻射誘導的凋亡率上升，增加細胞放射敏感性，在該細胞受到8 Gy60Coγ射線照射后4到24小時可以觀察到LyGDI蛋白斷裂成AN19LyGDI蛋白。 結論： 1.成功構建帶有GFP綠色熒光標記的pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達載體； 2.恢復L929細胞的P53表達抑制細胞增殖能力，增加細胞放射敏感性并發(fā)現(xiàn)P53外