富血小板血漿促進脂肪來源干細胞-支架復合物成骨的相關研究.pdf

1、背景與目的:
　　骨缺損是臨床上常見的癥狀，包括先天性和后天性。骨缺損的修復主要包括自體、異體骨移植和人工材料充填三種方法，但均有其自身無法克服的局限性。二十世紀八十年代，組織工程概念的提出為解決這一難題提供了新的思路和方法。由于骨缺損在臨床上的常見性和治療上的迫切性，使得骨修復成為目前組織工程研究中發(fā)展最快的領域。采用組織工程技術有望避免自體骨移植的缺點，利用自體具有成骨活性的種子細胞和可降解材料復合回植體內(nèi)，并使用相關的細胞因

2、子促進成骨，隨著材料的逐步降解，植入的成骨活性細胞分泌細胞外基質(zhì)，最終形成組織工程骨修復缺損，同時避免了自體骨供區(qū)的繼發(fā)性損傷。
　　組織工程骨的三大重要因素為種子細胞、支架材料和生長因子。
　　脂肪來源干細胞因其分布廣泛、來源充足、易于獲取等優(yōu)點成為組織工程種子細胞的優(yōu)先選擇之一。β-磷酸三鈣的主要成分與人骨的無機成分相似，是比較理想的骨組織工程人工支架材料。富血小板血漿制備簡單，并含有高濃度的生長因子，是目前自體生長因子

3、的主要來源，其含有的多種因子在促骨組織修復、加快新骨形成中具有極為重要的作用。
　　親和素-生物素橋接系統(tǒng)是近幾年發(fā)展很迅速的一門生物學技術，兩者之間的共價鍵是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的共價鍵，可以促進細胞在支架上早期粘附，有利于細胞的增殖。
　　本實驗在對脂肪來源干細胞和β-磷酸三鈣的研究基礎上，采用脂肪來源干細胞和生物素-親和素系統(tǒng)修飾的β-TCP支架復合富血小板血漿在動物體內(nèi)異位及原位分別構建組織工程骨，并研究富血小板血漿

4、對促進成骨的作用。
　　材料與方法:
　?。ㄒ唬┲緛碓锤杉毎蛛x、鑒定、培養(yǎng)和誘導分化
　　(1)自新西蘭大白兔的腹股溝切取脂肪組織，經(jīng)常規(guī)酶消化法提取脂肪來源干細胞，觀察細胞形態(tài);
　　(2)采用單克隆抗體標記ADSCs，然后采用細胞免疫組化測定干細胞表面標志物:CD29、CD34、CD44、CD105等;
　　(3)通過誘導分化劑的誘導，將ADSCs誘導分化成脂、成骨，通過油紅O染色、堿性磷酸酶染色和

5、Von Kossa染色了解干細胞成脂、成骨情況。
　?。ǘ│?磷酸三鈣支架的制備及特性鑒定
　　(1)以硝酸鈣和磷酸氫二銨溶液為原料，液相沉淀法制備納米級β-TCP粉體，以氯化銨為造孔劑，程序升溫法燒結成納米級多孔β-TCP支架材料;
　　(2)對材料的物相進行X線衍射、傅里葉紅外線轉換光譜分析儀測試，萬能試驗機測定材料的抗壓強度，液體靜力稱量法測定材料的孔隙率和吸水率;
　　(3)對材料的微觀結構進行掃描電子

6、顯微鏡觀察。
　?。ㄈ┥锼?親和素系統(tǒng)促進脂肪來源干細胞在β-磷酸三鈣支架上粘附的研究
　　(1)用CCK-8法檢測多孔β-TCP支架提浸液毒性;
　　(2)利用免疫熒光以及流式細胞儀檢測ADSCs生物素化的效率;
　　(3)采用CCK-8法檢測ADSCs與多孔β-TCP支架、生物素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架的粘附效率;
　　(4)采用掃描電鏡檢測ADSCs與多孔β-TCP支架、生物

7、素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架材料的表面情況。
　?。ㄋ模└谎“逖獫{促進脂肪來源干細胞與β-磷酸三鈣支架裸鼠體內(nèi)異位成骨的研究
　　(1)兩次離心法制備富血小板血漿;
　　(2)實驗分為四組:β-TCP組、β-TCP+PRP組、ADSCs+β-TCP組及ADSCs+β-TCP+PRP組，在裸鼠背部皮下異位成骨;
　　(3)8周后取出標本行蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色，進行組織學

8、觀察。
　　（五）富血小板血漿促進脂肪來源干細胞與β-磷酸三鈣支架修復兔下頜骨缺損的研究
　　(1)本實驗采用新西蘭大白兔，共6只分為兩組，包括A組（對照組）:ADSCs+β-TCP組;B組（實驗組）:ADSCs+β-TCP+PRP組。在兔下頜骨體制作骨性缺損，用材料復合物進行修復;
　　(2)在實驗第4周時處死兔，并行頭顱CT平掃，觀察支架與周圍骨的融合情況;
　　(3)4周后取出標本行蘇木精伊紅(HE)染色及

9、骨鈣素(OCN)染色，進行組織學觀察;
　　(4)熒光定量RT-PCR測骨鈣素(OCN)，堿性磷酸酶(ALP)的表達量。
　　結果:
　　1.自新西蘭大白兔腹股溝切取脂肪，經(jīng)常規(guī)酶消化法分離培養(yǎng)的細胞，具有干細胞的形態(tài)和特性，經(jīng)細胞免疫組化檢測其表面標志物的表達為CD29，CD44， CD105呈陽性表達，而CD34表達呈陰性表達;經(jīng)定向誘導分化，發(fā)現(xiàn)ADSCs具有成脂、成骨多向分化的潛能。
　　2.支架材料成分

10、為β-TCP，晶粒尺寸31.5nm，孔隙率71.26±0.28Vol％(n=5)，吸水率38.51±0.21Wt％(n=5)，抗壓強度7.93±0.06MPa(n=5)，孔隙均勻豐富，連通性好。
　　3.ADSCs與多孔β-TCP支架提浸液濃度100％、50％、10％、1％的相對增長率分別為107.48±10.32％、105.63±9.85％、108.51±12.06％、109.04±8.17％。生物素化的ADSCs熒光染色顯示生

11、物素結合部位在細胞胞質(zhì)，且流式細胞儀檢測提示生物素化細胞陽性率為95％。不同時間點(10分鐘、30分鐘、60分鐘、12小時、24小時)ADSCs與多孔β-TCP支架、生物素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架材料的粘附率分別為2.31±0.14％vs21.75±4.69％，11.96±2.53％vs54.82±12.37％,33.48±9.51％vs78.69±15.65％,78.29±10.63％vs95.46±7.38％,

12、94.79±10.42％vs98.13±1.45％。
　　4.裸鼠體內(nèi)構建異位組織工程骨的A組（β-TCP組）與B組(β-TCP+PRP組)的蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色僅有極少量細胞及成骨細胞外基質(zhì)著色。但是C組（ADSCs+β-TCP組）與D組(ADSCs+β-TCP+PRP組)的的HE染色及OCN染色可見大量細胞及成骨細胞外基質(zhì)著色，且D組比C組更為明顯。
　　5.兔下頜骨缺損修復實驗中頭顱CT三維成像

13、顯示支架與周圍骨的融合較好。蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色顯示更多細胞及細胞外基質(zhì)著色，實驗組比對照組更為明顯。
　　6.兔下頜骨缺損修復實驗中對A組（ADSCs+β-TCP組）與B組(ADSCs+β-TCP+PRP組)上ADSCs的cDNA進行PCR擴增反應，檢測兩個樣本骨鈣素(OCN)，堿性磷酸酶(ALP)的mRNA表達水平。A組的OCN表達值為17.49±3.52，B組的OCN表達值為26.38±7.17;A組

14、的ALP表達值為15.12±4.21，B組的ALP表達值為49.62±8.34。B組均優(yōu)于A組。
　　結論:
　　1.脂肪來源干細胞分離培養(yǎng)簡單，獲取容易，干性強，傳代穩(wěn)定，具有多向分化的潛能。
　　2.實驗制備的納米級β-TCP粉體反應完全，無雜質(zhì)，晶粒細膩，燒結出的納米級多孔β-TCP支架材料具有良好的孔隙結構和孔隙連通性，并具備一定的抗壓強度，可以作為支架材料為進一步的實驗所使用。
　　3.多孔β-TCP支