攜人血栓調(diào)節(jié)蛋白基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在內(nèi)皮祖細胞中的表達.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建攜帶人血栓調(diào)節(jié)蛋白(hTM)基因的慢病毒表達載體(plenti6.3-hTM-IRES-EGFP)，體外轉(zhuǎn)染兔外周血內(nèi)皮祖細胞(EPCs)并觀察其在EPCs中的表達及對內(nèi)皮祖細胞生物功能的影響。
　　方法：
　　從重組質(zhì)粒pcDNA3.1/hTM中提取hTM并采用DNA重組技術(shù)將hTM基因?qū)雙Lenti6.3-MCS-IRES-EGFP慢病毒表達載體中，篩選出陽性克隆與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞

2、產(chǎn)生病毒顆粒;采用密度梯度離心法分離兔外周血中內(nèi)皮祖細胞;將內(nèi)皮祖細胞分為實驗組、病毒對照組及空白對照組;實驗組與病毒對照組分別轉(zhuǎn)染plenti6.3-hTM-IRES-EGFP和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP;空白對照組內(nèi)皮祖細胞僅加入PBS作觀察;流式細胞儀法檢測plenti6.3-hTM-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染72h后用激光共聚焦顯微鏡觀察增強型綠色熒光蛋白表達情況，利用Q-PCR及Western blo

3、t法檢測細胞中mRNA及hTM蛋白的表達;Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光法鑒定EPCs;利用MTT法、transwell小室法檢測各組細胞增殖及遷移活性。
　　結(jié)果：
　　基因測序及Western blot法證實重組慢病毒載體plenti6.3-hTM-IRES-EGFP構(gòu)建成功。plenti6.3-hTM-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染EPCs72h后，綠色熒光蛋白表達率超過90％，流式細胞儀測定hTM陽性EPC

4、s達92.9％，Q-PCR及Western blot顯示轉(zhuǎn)染組EPCs hTM mRNA及蛋白表達呈明顯陽性，轉(zhuǎn)染組hTM mRNA表達明顯高于對照組。實驗組、病毒對照組及空白對照組EPCs的增殖及遷移活性無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建plenti6.3-hTM-IRES-EGFP重組慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染兔外周血EPCs后，在體外能高效表達基因產(chǎn)物且不影響EPCs的生物學(xué)功能，為進一步研究hTM在動脈血栓疾病中的作