快速老化小鼠聽功能、耳蝸NGFR TrkA的增齡性變化以及NGF轉染骨髓基質干細胞的培養(yǎng).pdf

1、目的:探討快速老化小鼠聽覺功能、耳蝸組織中神經(jīng)生長因子受體酪氨酸激酶受體A(nerve growth factor receptor TrkA，NGFR TrkA)表達的增齡性變化以及NGF轉染骨髓基質干細胞的培養(yǎng)，為老年性耳聾發(fā)病的分子機制和基因治療提供理論基礎。
　　方法:該研究選用3、5、7月齡的快速老化小鼠亞系8(SAMP8)作為觀察對象。采用聽覺誘發(fā)反應儀檢測其8kHz短純音ABR閾值;應用免疫組化染色檢測NGFRTrk

2、A在耳蝸組織中的表達情況，并應用光密度檢測分析其增齡性變化特點。將欲轉染的小鼠骨髓基質干細胞分為四組:A組為脂質體2000包裹的重組質粒轉染組;B組為脂質體轉染組;C組為脂質體包裹的空質粒轉染組;D組為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對照組。按質粒提取試劑盒說明提取含NGF重組質粒的陽性克隆大腸桿菌，將提取的重組質粒經(jīng)限制性內切酶HindⅢ and XhoⅠ雙酶切鑒定后，采用脂質體Lipofectamine TM 2000

3、轉染方法將含有人β-NGF神經(jīng)生長因子的重組質粒轉染至小鼠骨髓基質干細胞中，于轉染48小時后用4％多聚甲醛固定各組細胞并通過細胞免疫組化染色檢測NGF的表達情況。
　　結果:1、各組SAMP8小鼠聽性腦干反應閾值(ABR)分別為:3月齡SAMP8小鼠:左耳為31.667±2.582，右耳為32.500±2.739;5月齡SAMP8小鼠:左耳為54.167±2.041，右耳為53.333±2.582;7月齡SAMP8小鼠:左耳為58

4、.333±2.582，右耳為58.333±2.582。5月齡與3月齡進行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進行比較P＜0.05有顯著性差異。2、NGFRTrkA蛋白在不同月齡快速老化小鼠耳蝸組織中均有表達，且主要表達于螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和內外毛細胞的胞核和胞漿。各組小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞TrkA免疫組化染色平均光密度值分別為:3月齡SAMP8小鼠:0.5262±0.0148;5月齡SAMP8小鼠:0.4758±0.0129;7月齡SAMP8小

5、鼠:0.4505±0.0148。5月齡與3月齡進行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進行比較P＜0.05有顯著性差異。各組小鼠耳蝸內外毛細胞TrkA免疫組化染色平均光密度值分別為:3月齡SAMP8小鼠:0.6311±0.0200;5月齡SAMP8小鼠:0.5487±0.0179;7月齡SAMP8小鼠:0.5183±0.0187。5月齡與3月齡進行比較P＜0.05，7月齡與5月齡進行比較P＜0.05有顯著性差異。3、各組骨髓基質干細胞胞漿均

6、可見棕黃色顆粒，且脂質體2000包裹的重組質粒轉染組(A組)NGF表達明顯高于其他組，與其他組進行比較P＜0.05有顯著性差異。
　　結論:NGFRTrkA蛋白的表達水平隨著快速老化小鼠聽覺功能增齡性減退而降低，說明NGFRTrkA可能與維持耳蝸的功能狀態(tài)有關;采用脂質體LipofectamineTM2000轉染方法能將NGF重組質粒成功轉染至骨髓基質干細胞并能在中表達，為應用β-NGF修飾的骨髓基質干細胞進行耳蝸移植治療老年聾的