siRNA干擾B因子基因的表達及其抑制大鼠脈絡膜新生血管的實驗研究.pdf

1、目的：在眼部疾病中，血管增生過度是一大類致盲性眼病的根本原因，其中脈絡膜新生血管性疾病占據(jù)較大比例。脈絡膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)的生長及其所導致的出血、滲出、增生等是多種致盲眼病的主要病理過程。血管新生是多種分子共同作用的結果，而以往的研究多是針對單分子來控制血管新生，這些方法雖然顯示出一定抑制作用，但畢竟單分子作用是微弱的，并且都不能從根本上解決CNV的發(fā)生及其復發(fā)問題，故抗血管新

2、生的作用也是有限的。最新研究表明補體活化的旁路途徑可能是激光誘導大鼠CNV生成的相關因素的根本原因。為了進一步探討旁路途徑在激光誘導的CNV生成中的作用，本研究利用了旁路途徑中一個重要因子B因子(complement factor B，CFB)作為阻斷旁路途徑的靶點，觀測補體活化的旁路途徑對CNV生成及其相關生長因子表達的抑制作用。 方法：1 CFB-siRNA表達載體的構建 1.1 以人CFB mRNA為模板，設計與大

3、鼠同源的、針對CFB基因編碼區(qū)的CFB-siRNA序列，并在體外轉錄合成。 1.2 雙酶切質粒pRNAT-U6.1/Neo，與CFB-siRNA鏈連接，構建CFB-siRNA表達載體，轉化至感受態(tài)細胞(E.coli)后采用PCR、雙酶切(BamHI和HindIII)、膠回收、連接后得到重組質粒pRNAT-U6.1/CFB-siRNA，并進行測序鑒定和PCR鑒定。 1.3 用電轉染技術將重組質粒pRNAT-U6.1/CFB

4、-siRNA轉染人臍靜脈內皮細胞ECV-304(電轉參數(shù)：電容：900μF，電壓0.2kv，電阻：+8，時間：70ms，脈沖次數(shù)：1次)，命名為CFB-siRNA組；將等量空質粒以同樣條件轉染ECV-304，命名為空質粒組；未轉染細胞命名為正常對照組。 1.4 轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48h后于倒置熒光顯微鏡下觀察質粒的轉染效率。收集各組ECV-304進行RT-PCR，測定CFB mRNA的表達，并用Bandleader凝膠圖像分析軟件對

5、凝膠電泳條帶進行灰度值分析；四甲基偶氮唑藍法(MTT)檢測各組細胞的生長抑制率；流式細胞儀檢測細胞周期。 1.5 統(tǒng)計學方法：凝膠電泳條帶灰度值用-X±s表達，兩個樣本均數(shù)的比較用t檢驗；計數(shù)資料用X2檢驗。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包統(tǒng)計。P＜0.05為差異有顯著性意義。 2重組CFB-siRNA抑制激光誘導的大鼠脈絡膜新生血管生成的體內實驗 2.1 CNV模型的建立：健康成年棕色挪威(BrownNorway，BN

6、)大鼠42只，激光光凝方式建立CNV動物模型，隨機分為尾靜脈注射組，玻璃體腔注射組，視網(wǎng)膜下腔注射組，對照組。三種不同的注射方式組分別設有相應的空質粒注射組。共7組，6只/組。 2.2 光凝后第1、3、5天分別給予各組的大鼠進行注射，對照組光凝后不給予任何干預。 2.3 玻璃體注射組和視網(wǎng)膜下腔注射組在注射后第1、2、3天觀察其晶體、玻璃體及視網(wǎng)膜情況。 2.4 光凝后第7天、第14天行熒光素眼底血管造影(fun

7、dus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)，根據(jù)熒光滲漏程度對各光凝斑評分來檢測新生血管的生成情況。 2.5 免疫組織化學法從蛋白水平檢測各組大鼠脈絡膜內血管生成相關因子：血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、第Ⅷ因子(factorⅧ)的表達情況。Imagepro plus圖像分析軟件進行吸光度值檢測。 2.6 統(tǒng)計學方法：計數(shù)資料用x2檢

8、驗。免疫組化結果的吸光度值(A)用X±s表達。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包統(tǒng)計。P＜0.05為差異有顯著性意義。 結果：1 CFB-siRNA表達載體構建 1.1 將CFB-siRNA定向插入到pRNAT-U6.1的BamH Ⅰ和HindⅢ內切酶位點，測序結果顯示同設計序列完全相同，表明人CFB-siRNA真核表達載體構建成功。 1.2 倒置熒光顯微鏡下，轉染CFB-siRNA、空質粒的ECV-304細胞均可看見清晰

9、的綠色熒光，說明轉染成功。 1.3 收集ECV-304細胞，提取RNA，RT-PCR檢測重組質粒對CFB mRNA的抑制率，結果顯示，與正常對照組和空質粒組相比，CFB-siRNA組對CFB有明顯的抑制效果(P＜0.05)。 1.4 MTT法檢測CFB-siRNA組的細胞在24h的抑制率為23.45％，48h的抑制率為33.48％，72h的抑制率為45.49％，而空質粒組對ECV-304細胞生長沒有影響。 1.5

10、 流式細胞儀結果顯示，CFB-siRNA對ECV-304的抑制作用主要是將ECV-304的生長阻滯在細胞周期的間期G1期。 2重組CFB-siRNA抑制激光誘導的大鼠脈絡膜新生血管生成的體內實驗 2.1 健康成年BN大鼠42只，激光光凝方式建立CNV模型，隨機分為7組，每組6只：(1)CFB-siRNA尾靜脈注射組；(2)空質粒尾靜脈注射組；(3)CFB-siRNA玻璃體腔注射組；(4)空質粒玻璃體腔注射組；(5)CFB

11、-siRNA視網(wǎng)膜下腔注射組；(6)空質粒視網(wǎng)膜下腔注射組；(7)對照組(光凝后不予處理)。 2.2 玻璃體注射組和視網(wǎng)膜下腔注射組在注射后第1、2、3天觀察晶體、玻璃體均透明，無明顯炎性反應，視網(wǎng)膜在位。 2.3 各光凝斑熒光滲漏程度評分結果顯示：CFB-siRNA尾靜脈注射組與其它各組相比熒光滲漏程度輕，且差別有顯著意義(P＜0.05)。 2.4 免疫組化結果：CFB-siRNA尾靜脈注射組VEGF、fact

12、orⅧ的陽性表達強度不同時間點之間無顯著差異(P＞0.05)，而與同時間點其它各組相比明顯降低，且差異有顯著意義(P＜0.05)。其它各組不同時間點VEGF、factorⅧ的陽性表達強度，光凝后14d顯著強于光凝后7d，差異有顯著性(P＜0.05)。 結論：1體外重組CFB-siRNA可高效地沉默CFB基因的表達，為第二部分的體內試驗提供了工具。 2經(jīng)電轉染方法成功的將重組CFB-siRNA轉染ECV-304，并在一定程

13、度上抑制ECV-304細胞的增殖。 3激光光凝的方法成功誘導BN大鼠CNV模型，方法簡單易行，成模時間短，成模率高，可用來模仿人類CNV病變進行防治研究。 4重組CFB-siRNA能有效的抑制體內CNV的生成，并且從蛋白水平證明能下調VEGF及factorⅧ的表達水平。 5尾靜脈快速注射重組CFB-siRNA對于CNV的抑制效果最佳。 6本研究為脈絡膜新生血管性疾病的基因治療方案，提供了新的可靠實驗數(shù)據(jù)和