動物源性大腸桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥及其相關(guān)機制的研究.pdf

1、氨基糖苷類抗生素是一類高效廣譜的抗生素，由于在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，細菌對其產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致該類抗生素在治療中的作用受到了限制，但它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，活性，藥動力學(xué)等方面的研究已成熟，半合成的氨基糖苷類抗生素難以在結(jié)構(gòu)上有所改變，所以了解細菌的耐藥機制已是刻不容緩。 本研究主要經(jīng)最低抑菌(MIC)測定從臨床分離的15株大腸桿菌中篩選2株高度耐藥株，4株中度耐藥株，1株低程度耐藥株，從不同的角度對這7株耐藥菌耐藥機制進行研究

2、，以期對氨基糖苷類抗生素耐藥性的監(jiān)測、控制作出有益的探索。 首先選取鈍化氨基糖苷類藥物三種酶的五種基因acc(6')-Ib，acc(3)-IV，aadA，aphA，aph(2")對7株耐藥菌進行PCR擴增，這幾種基因所編碼的鈍化酶在大腸桿菌中較為常見，但僅有aphA基因擴增成功，所以初步斷定引起這幾株菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制是aphA編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用。 然后通過實時熒光定量RT-PCR方法對這7株耐藥菌a

3、phA基因mRNA表達水平進行定量檢測，方法主要是設(shè)計參比引物構(gòu)建表達載體，提取大腸桿菌的RNA，并反轉(zhuǎn)錄，利用所設(shè)計的檢測引物進行實時熒光定量RT-PCR。結(jié)果得出不同耐藥強度的大腸桿菌aphA基因mRNA表達水平存在著差異，二者呈正相關(guān)，并且通過耐藥性和表達水平的差異，推斷出這7株菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制是aphA基因產(chǎn)生的磷酸轉(zhuǎn)移酶的鈍化作用。 同時也通過westernblotting的方法對aphA基因蛋白表達

4、進行了定性檢測，其方法是將aphA基因克隆表達，將表達后的蛋白作為抗體免疫動物，制備抗體血清，通過westernblotting的方法對不同耐藥強度的大腸桿菌aphA基因蛋白表達水平進行檢測，得出耐藥強度同大腸桿菌aphA基因蛋白表達水平成正相關(guān)，結(jié)論與上述方法相一致。 通過上述結(jié)果的進一步分析4株中度耐藥菌的耐藥強度相當(dāng)，所檢測到表達水平也相當(dāng)，所以引起它們的主要耐藥機制就是aphA基因編碼鈍化酶的作用。高度耐藥的兩株菌在檢測

5、中aphA基因的表達有差異，但它們的耐藥強度相當(dāng)，所以還應(yīng)有其他的耐藥機制存在。為了能更深入了解兩株高度耐藥菌(7、5號)的差異所在，本實驗選取了編碼16SrRNA基因rrsA和核糖體蛋白基因rpsL，將其克隆到pGEM-TEasy載體上，觀察這兩個基因編碼的核糖體突變情況，其中7號菌的apA基因的表達水平較低，其rrsA基因發(fā)生了突變，5號菌未發(fā)生突變，而rpsL基因均未見突變。由此可見引起7號菌對氨基糖苷類藥物耐藥是由rrsA，ap