Sprouty2介導的FoxO3a促腦膠質瘤細胞凋亡作用的體外實驗研究.pdf

1、目的:觀察FoxO3a通過Sprouty2對腦膠質瘤U251細胞凋亡的影響，并探究相關作用機制，探尋膠質瘤基因治療新的靶點。 方法: 1.FoxO3a-pcDNA3.1真核表達載體經Nco I、Hind Ⅲ酶切后用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。 2.體外培養(yǎng)的U251細胞被隨機分為四組：實驗組，空載體組，脂質體組及空白對照組。采用陽離子脂質體將FoxO3a-pcDNA3.1真核表達載體轉染至U251細胞，經G418篩選

2、獲得穩(wěn)定表達非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細胞。經4-OH Tamoxifen誘導，分別于24h、48h、72h收集細胞，Western blot檢測FoxO3a、Sprouty2的表達情況，Hoechst33258染色試劑盒及FACS法檢測細胞凋亡情況。 3.構建Sprouty2 siRNA；U251細胞被隨機分為四組：實驗組，脂質體組，siRNA陰性對照組及空白對照組；Sprouty2 siRNA經陽離子脂質

3、體轉染4-OH Tamoxifen誘導的U251/FoxO3a細胞，分別于轉染后24 h、48 h、72 h收集細胞，Western blot檢測Sprouty2的表達，Hoechst33258染色試劑盒及FACS法檢測細胞凋亡情況。 結果: 1.FoxO3a-pcDNA3.1真核表達載體轉染U251細胞，經G418篩選獲得穩(wěn)定表達非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細胞株。 2.U251細胞FoxO3

4、a T32位點磷酸化水平高于正常星形膠質細胞。 3.Western blot檢測結果顯示，在4-OH Tamoxifen誘導U251/FoxO3a后24 h、48 h、72 h，實驗組Sprouty2表達水平高于對照組；Sprouty2 siRNA轉染4-OH Tamoxifen誘導的U251/FoxO3a細胞后24h、48h、72h，實驗組Sprouty2表達水平低于對照組。 4.Hoechst33258染色、FACS

5、檢測細胞凋亡率顯示：4-OH Tamoxifen誘導U251/FoxO3a細胞后24h、48h、72h，實驗組U251/FoxO3a細胞凋亡率高于對照組；Sprouty2 siRNA轉染4-OH Tamoxifen誘導的FoxO3a/U251細胞后24h、48 h、72 h，實驗組細胞凋亡率低于陰性對照組。 結論： 1.獲得穩(wěn)定表達非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細胞株。 2.FoxO3a的轉錄活性