TAT-CT-1，TAT-EGFP融合蛋白的表達，純化及其在小鼠體內(nèi)分布的初步觀察.pdf

1、當今社會，脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)呈現(xiàn)出高發(fā)生率、高致殘率、高耗費、低死亡率、青壯年患者居多的特點，加強SCI救治有十分重要的意義。而其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子在SCI后明顯促進神經(jīng)元的存活，并上調(diào)再生相關基因。 心肌營養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是1995年由Pennica等發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，由203個氨基酸組成，能夠刺激體外新生大鼠心肌的生長，與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliaryn

2、eurotrophicfactor，CNTF)同屬于IL-6家族。由于與CNTF的同源性，CT-1對神經(jīng)系統(tǒng)的作用越來越引起人們的注意。CT-1能長時間的支持運動神經(jīng)元(包括脊髓和腦運動神經(jīng)元)、多巴胺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活。已報道CT-1基因治療大鼠進行性運動神經(jīng)元病、脊髓側(cè)束硬化(acutelateralsclerosis，ALS)的動物實驗，并取得較好的效果。張正豐等克隆了人CT-1基因、原核表達并純化了重組CT-1蛋白、構建了

3、人CT-1重組腺病毒載體，并用于神經(jīng)損傷方面的研究；在周圍神經(jīng)損傷方面，將純化的重組CT-1蛋白置于成年大鼠坐骨神經(jīng)切斷后橋接的硅膠管，發(fā)現(xiàn)重組CT-1蛋白促進坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元的存活。 但是，由于神經(jīng)營養(yǎng)因子無法通過血腦屏障且半衰期短，CT-1等可溶性生物大分子物質(zhì)很難通過血腦屏障，從而限制了CT-1的應用及給藥方式。因此，向脊髓損傷區(qū)域提供高效特異的神經(jīng)營養(yǎng)相關因子對脊髓傳導束的保護和再生一直是SCI及其修復的

4、研究熱點。而長期、反復和方便的給藥方式也是SCI研究的技術難點。 人類免疫缺陷病毒-1(humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1)編碼的反式激活蛋白TAT中含有一段與蛋白轉(zhuǎn)導功能相關聯(lián)的多肽片段，稱之為蛋白轉(zhuǎn)導域(proteintransductiondomain，PTD)。雖然來源于HIV-1，但它不具備任何復制性和毒性。TAT-PTD介導的蛋白轉(zhuǎn)導過程不依賴于靶細胞膜上的受體和轉(zhuǎn)運蛋白，也不需要能量，

5、在4℃下仍然可以進行。目前推測這一過程和PTD中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關，這些氨基酸帶有強的正電荷，可能通過直接與帶負電荷的細胞膜脂類相互作用而介導穿膜過程。這也使得其可以導入近乎所有的細胞，包括破骨細胞、外周血單核細胞及原代細胞等常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染的細胞，甚至還可以穿過血腦屏障。 本實驗的目的是利用大腸桿菌高效表達可溶性重組TAT/CT-1蛋白，并觀察其在小鼠體內(nèi)的分布，以滿足對CT-1生物學作用進一步研究的需要。

6、 增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)是生命科學中常用的示蹤劑，具有無種屬特異性，無須抗體、輔因子或酶底物等其他介質(zhì)，即可在活細胞中及固定的組織樣品中直接進行檢測等特點，故本研究擬同時構建TAT/EGFP質(zhì)粒，為融合蛋白在動物體內(nèi)的分布觀察提供方便。 本課題的研究主要包括以下三個部分，所用到的主要方法及結(jié)果如下： 第一部分融合原核表達質(zhì)粒pGEX-TAT/

7、CT-1，pGEX-TAT/EGFP的構建 1.采用PCR技術擴增CT-1基因，膠回收擴增后的CT-1，后直接進行雙酶切。雙酶切后的CT-1基因再次膠回收，純化后與經(jīng)雙酶切，膠回收純化的pGEX-4T3載體在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌落在37℃下震搖過夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預期地方出現(xiàn)目的條帶。命名此質(zhì)粒為pGEX-CT-1。雙酶切TAT基因，膠回收后與雙酶切，膠回收純化的載體在16℃連接過

8、夜，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌落在37℃下震搖，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預期地方出現(xiàn)目的條帶。命名此質(zhì)粒為pGEX-TAT/CT-1，測序顯示無PCR引起的突變，基因無移碼，質(zhì)粒構建成功。 2.采用PCR技術對EGFP基因進行擴增，膠回收擴增后的EGFP，純化后直接進行雙酶切。雙酶切后的EGFP基因再次膠回收，純化后與經(jīng)雙酶切，膠回收純化的載體pGEX-TAT在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌

9、落在37℃下震搖過夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預期地方出現(xiàn)目的條帶，命名此質(zhì)粒為pGEX-TAT/EGFP，測序顯示無PCR引起的突變，基因無移碼，質(zhì)粒構建成功。 第二部分融合蛋白TAT/CT-1，TAT/EGFP的表達與純化 將原核表達質(zhì)粒pGEX-TAT/CT-1，pGEX-TAT/EGFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21中后，經(jīng)過IPTG誘導4小時，超聲裂菌，離心，分別對上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明

10、表達的TAT/CT-1，TAT/EGFP蛋白均有可溶性和包涵體兩種存在形式。雖然在37℃誘導時蛋白表達量最高，但包涵體含量也高；降低誘導溫度，在25℃時，TAT/CT-1,TAT/EGFP可溶性蛋白含量均為最高。因此本實驗采用25℃誘導4小時為誘導條件。 重組菌經(jīng)超聲裂解后，上清經(jīng)瓊脂糖谷胱甘肽4B孵育，還原性谷胱甘肽洗脫，產(chǎn)物SDS-PAGE分析表明在相對分子量49.7×103，和55.1×103處分別由有與TAT/CT-1和

11、TAT/EGFP融合蛋白分子量相當?shù)牡鞍讞l帶。融合蛋白純度均達90％左右，濃度均在1.2mg/ml以上， 第三部分融合蛋白TAT/CT-1，TAT/EGFP在小鼠體內(nèi)分布的初步觀察 體重28-32g的昆明小鼠經(jīng)尾靜脈分別注射約含500μgTAT/CT-1,TAT/EGFP融合蛋白的無菌溶液0.5ml。注射4小時后戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，由左心室用生理鹽水50ml沖洗，取腦，脊髓，肝，心肌等器官組織做恒冷箱切片，片厚10μ