先天性巨結腸腸神經(jīng)系統(tǒng)及血清中Neuroligin基因與谷氨酸的表達和意義.pdf

1、目的:作為一種常見的消化道先天性畸形和典型的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，先天性巨結腸(Hischsprung's disease，HD)的大體病理改變主要為病變腸段腸神經(jīng)節(jié)細胞的缺如，病變腸管痙攣狹窄，病變腸段近端的結腸由于蠕動加強而代償性肥厚擴大，最終引起巨結腸的發(fā)生。臨床上以嘔吐、腹脹、便秘為主要表現(xiàn)，可出現(xiàn)腸梗阻、腸穿孔以及小腸結腸炎等并發(fā)癥，嚴重者會危及生命。雖然關于其病因研究的學說有很多，但都不能完全解釋其發(fā)病機制。在常見的基因

2、異常學說中，與HD密切相關的RET等許多基因（SOX10基因、ECE1基因等）的突變只在大約50％的家族性病例患兒和7％到35％的散發(fā)病例患兒中發(fā)現(xiàn)，所以這種學說無法全面地解釋HD的發(fā)病機制;腸道微環(huán)境異常學說認為細胞外基質成分的過度增多，導致了腸神經(jīng)嵴細胞由于過早分化、成熟、粘附、聚集而無法正常遷移達到結腸遠端導致了該消化道畸形的發(fā)生，然而有研究發(fā)現(xiàn)盡管在HD患兒痙攣段腸管中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)絀胞，但在其盆腔神經(jīng)叢支配的膀胱、前列腺等臟器內(nèi)

3、卻發(fā)現(xiàn)了正常的的神經(jīng)節(jié)絀胞，故僅用腸道微環(huán)境的異常解釋導致腸神經(jīng)嵴細胞遷移的停止而導致HD發(fā)生也是不全面的;此外還有腸道Cajal間質起搏細胞(inters titial cells of cajal，ICC)異常學說認為ICC數(shù)量的減少和網(wǎng)格狀結構的破壞與HD關系密切，由于ICC的異常導致腸道起搏功能的障礙，使腸道慢波活動喪失，導致HD的發(fā)病。但是同時也有實驗證實有些HD病例的無神經(jīng)節(jié)細胞段中ICC的分布及數(shù)量與正常腸管并無太大差異。

4、所以這種單一的理論也無法完全闡釋HD的發(fā)病機理。這些學說都只是在某一方面說明一部分病人的發(fā)病機制，不能形成一套統(tǒng)一全面的基礎理論。而由于基礎理論的不確定，導致對該病的診斷、鑒別以及分型都存在一定的局限和困難。
　　本研究擬從神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育異常的角度，討論已經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)中研究地較為深入的突觸后跨膜吸附蛋白的編碼基因Neuroligin基因及相應的突觸后跨膜吸附蛋白Neur

5、oligins蛋白在HD腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System，ENS)中肌間神經(jīng)叢Cajal間質細胞(inters titial cellsof cajal within the myenefic region，ICC-MY)的表達情況，并進一步研究Neuroligin-1蛋白亞型及其相關的谷氨酸(Glutamate，Glu)在HD病人腸管ENS中和血液中的表達，從ENS突觸功能異常的角度討論Neuroligin基因

6、及Glu的表達和變化與HD發(fā)病的關系，進而探討其對HD發(fā)病機制的基礎研究和臨床實踐的意義。
　　方法:腸管和血液標本取自2010年至2013年間山東大學齊魯醫(yī)院小兒外科收治的90例病理診斷為HD的患兒（短段型50例，長端型40例），另取50例腹股溝斜疝患兒(indirect inguinal hernia，ⅡH)的血液標本作為對照。為減小研究誤差，我們控制入選研究的各組患兒的年齡、基礎代謝率以及營養(yǎng)狀況（包括身長、體重、血清總蛋白

7、、血清白蛋白、血紅蛋白、血尿素氮等等）之間無統(tǒng)計學差異。
　　收集HD切除腸管的狹窄段（無神經(jīng)節(jié)細胞段）、移行段和擴張段近端（正常段、有神經(jīng)節(jié)細胞段）。部分新鮮組織置于-80℃儲存用于Western-blot和qRT-PCR，進行Neuroligin-1，2，3，4(Neuroligins)、Neuroligin-1和Glu的定量分析和比較;部分組織制備腸肌間神經(jīng)叢鋪片(Longitudinal muscle with adher

8、entmyenteric plexus，LMMP)用于免疫化學染色研究Neuroligins、Neuroligin-1和Glu在ENS的表達情況和ICC-MY的分離培養(yǎng);部分組織制備石蠟切片用于免疫組化染色研究Neuroligin-1的表達情況;免疫磁珠分選(Magnetic-activated CellSorting，MACS)和流式絀胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)用于ICC-MY的分選和計數(shù)。
　　收集HD和ⅡH

9、患兒的血清，-80℃儲存?zhèn)溆?，使用ELISA技術檢測各自的血清Glu含量并通過進行長段型HD、短段型HD和非HD之間的比較研究其對HD診斷、鑒別以及臨床分型的重要意義。
　　數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標準差”表示，兩組數(shù)據(jù)組間比較采用配對t檢驗進行分析，三組數(shù)據(jù)之間兩兩比較采用單因素方差分析和Turkey's檢驗進行分析。使用SPSS11.5和GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:

10、(1)對LMMP進行免疫組化染色證實ICC-MY表達于LMMP，細胞之間相互聯(lián)系從而構成網(wǎng)格狀結構，且該網(wǎng)格狀結構在無神經(jīng)節(jié)細胞段和有神經(jīng)節(jié)細胞段之間并無明顯差異。(2)對LMMP進行雙重免疫熒光染色證實Neuroligin-1，2，3，4蛋白表達于ICC-MY，且Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細胞段構成的網(wǎng)格結構不完整，說明Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細胞段表達減少。(3)以新鮮LMMP分離培養(yǎng)細胞后，通過MACS純化分

11、選出ICC-MY，并使用FCM進行細胞計數(shù)，證實雖然分選出的ICC-MY細胞數(shù)由擴張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，但三組細胞中含有的ICC-MY比例并無明顯差異。(4)使用細胞免疫熒光染色對分選出的細胞進行染色，證實為梭形和紡錘形的ICC-MY。(5)以ICC-MY的特異性抗體C-kit為參考，使用Western-blot技術對來自狹窄段、移行段、擴張段近端的細胞中的Neuroligins蛋白進行分析，證實Neuroligins蛋白

12、的表達量由擴張段近端到移行段再到狹窄段逐漸降低。(6)雙重免疫熒光技術顯示Neuroligin-1蛋白和Glu在LMMP表達于同一部位且在無神經(jīng)細胞段的表達少于有神經(jīng)節(jié)細胞段。(7)免疫組化顯示，Neuroligin-1蛋白在石蠟切片的表達由擴張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，Glu在LMMP的表達也由擴張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少。(8)Western-blot和qRT-PCR顯示Neuroligin-1和Glu的表達由擴張段

13、近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義，與免疫化學顯示結果相符。(9)ELISA檢測血清Glu顯示，由長段型HD到短段型HD再到非HD，血清Glu的含量逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:通過上述實驗和所得到的結果我們可以得到以下結論:(1) Neuroligins蛋白表達于HD患兒ENS中的ICC-MY，其表達量由狹窄段到移行段再到擴張段近端的變化可能會導致ICC-MY突觸功能的異常，突觸功能的異常會進而影響ENS

14、中神經(jīng)沖動和神經(jīng)信號的傳遞，繼而導致由ICC-MY引發(fā)的腸道起搏功能受損，使得病變段的腸管喪失蠕動功能，最終導致HD的發(fā)生。(2)Neuroligin-1蛋白亞型和與其密切相關的Glu在HD患兒的ENS同一部位表達，這不僅可能作為ENS中神經(jīng)元，特別是興奮性神經(jīng)后突觸的新的分子標記，其表達量由狹窄段到移行段再到擴張段近端的變化也可能會通過引發(fā)興奮性突觸后功能的異常進而導致腸道舒縮異常最終形成了HD的發(fā)生。(3)血清Glu含量的檢測以及其