TGF-β1基因修飾兔B型滑膜細(xì)胞復(fù)合Pluronic-F127構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、目的： 體外分離培養(yǎng)兔B型滑膜細(xì)胞(type B synoviocytes)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF—β1)的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF—β1質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔B型滑膜細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞復(fù)合Pluronic—F127在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體內(nèi)向軟骨組織方向分化的可行性，為基因加強組織工程學(xué)修復(fù)軟骨損傷提供實驗依據(jù)。

2、 方法： 1、取3月齡健康新西蘭大白兔，雌雄不限，耳緣靜脈注射空氣處死，嚴(yán)格消毒下，迅速開腹切取小塊肝臟組織，置入凍存管，立即投入液氮中冷凍備用；同時打開膝關(guān)節(jié)，用眼科鑷撕取關(guān)節(jié)腔內(nèi)面的滑膜組織，將術(shù)中取到的組織迅速帶入無菌室，分別應(yīng)用酶消化法行滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增，貼壁篩選、單一膠原酶消化和多次傳代法相結(jié)合行純化培養(yǎng)，同時進行抗Vimentin、抗CD68免疫組化鑒定細(xì)胞。 2、取出液氮中冷凍的肝臟組織，研磨成粉末，

3、Trizol法提取總RNA，分析TGF—β1mRNA序列，設(shè)計引物，用cDNA合成試劑盒合成cDNA，并行二次PCR擴增；將帶有pcDNA3.1(+)的菌株行擴增、搖菌、抽質(zhì)粒，將擴增后的TGFβ1cDNA和pcDNA3.1(+)進行酶切，將目的片段連接載體，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定轉(zhuǎn)化菌，Amp篩選，對陽性菌克隆提質(zhì)粒，進行酶切鑒定，將陽性菌液送測序鑒定。 3、轉(zhuǎn)染前一天，取第三代滑膜細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞

4、懸液，接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105，待細(xì)胞生長至80％融合時，按lipofectamine2000試劑盒說明行pcDNA3.1-TGFβ1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，同時取另一6孔板行pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，上述兩組分別為實驗組和對照組，以軟骨細(xì)胞為陽性對照組。實驗組、實驗對照組轉(zhuǎn)染后48小時行G418篩選陽克隆，每兩天取部分細(xì)胞做細(xì)胞計數(shù)，連續(xù)12天，繪制細(xì)胞生長曲線，取部分陽性細(xì)胞行RT—PCR檢測TGF—β1、Ⅱ型膠原、糖氨多糖的

5、瞬時表達(dá)，對RT—PCR結(jié)果用ScnImage軟件分析處理，計算相對灰度值，所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS13.0行統(tǒng)計學(xué)處理，各間兩兩比較，采用方差分析，P值<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義；另取部分陽性細(xì)胞做細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定后行TGFβ1、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。 4、在4℃將Pluronic—F127溶解，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％液體，然后與轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進行混合，同時取軟骨細(xì)胞混合Pluronic—F127、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞

6、混合Pluronic—F127作為對照組，各組細(xì)胞濃度均為5×107/mL的復(fù)合物，迅速以0.2ml注射器行裸鼠背部皮下注射，分別在術(shù)后4、6、8周處死實驗裸鼠，取出裸鼠背部組織進行大體標(biāo)本觀察后，制成5μ m厚切片，切片行蘇木素—伊紅(HE)染色光鏡下觀察骨組織及軟骨組織形成情況，同時進行抗Ⅱ型膠原、抗TGF—β1免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果： 1、兔滑膜來源的B型細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，細(xì)胞呈梭形和多角形，活性良好，細(xì)胞可傳代

7、10代而無明顯退變跡象，進行免疫組化鑒定，抗Vimentin為陽性、抗CD68為陰性，可與A型滑膜細(xì)胞鑒別。 2、成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGFβ1，質(zhì)粒酶切后電泳顯示有pcDNA3.1和TGFβ1片段，測序結(jié)果完全符合TGFβ1 DNA序列。 3、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后，生長曲線顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長活性較陽性對照組降低，實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天，RT—PCR檢測到TGFβ1、Ⅱ型膠原、糖氨多糖陽性片段，實驗對照組為陰

8、性；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第4天至3周，抗TGF—β1、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色實驗組可見細(xì)胞內(nèi)陽性顆粒，對照組為陰性。 4、分別在4、6、8周處死實驗裸鼠，取出各組裸鼠背部組織進行大體標(biāo)本觀察，見實驗組以及軟骨細(xì)胞混合Pluronic—F127組可形成透明軟骨樣組織，抗Ⅱ型膠原、抗TGF—β1免疫組織化學(xué)檢測均為陽性，在空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合Pluronic—F127組均未見軟骨樣組織形成，免疫組化結(jié)果為陰性。 5、統(tǒng)計分析顯示，轉(zhuǎn)染

9、后各組RT—PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后TGFβ1、Ⅱ型膠原及糖氨多糖表達(dá)高于空載體組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組與陽性對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 脂質(zhì)體法重組pcDNA3.1-TGF—β1基因轉(zhuǎn)染的兔B型滑膜細(xì)胞，可表達(dá)TGF—β1，細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和糖氨多糖，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞樣生理特征，并在3周內(nèi)未見明顯減退，裸鼠體內(nèi)實驗顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞混合Pluronic—F127在8周時可形成類軟骨樣組織；B型滑膜細(xì)胞具有向軟骨樣