多烯紫杉醇在體內(nèi)外對人肝細胞肝癌抑制生長及放射增敏實驗研究.pdf

1、第一部分,多烯紫杉醇抑制人肝細胞肝癌(HCC)生長及誘導細胞凋亡.目的:在體內(nèi)外探討多烯紫杉醇(docetaxel)對人HCC生長抑制的影響,并初步探索多烯紫杉醇誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其機理.方法:用不同濃度的多烯紫杉醇處理SMMC-7721細胞,用集落形成試驗檢測多烯紫杉醇對SMMC-7721細胞生長抑制作用,通過流式細胞術(shù)測定多烯紫杉醇對SMMC-7721細胞株細胞周期及凋亡的影響、丫啶橙/溴化乙啶(acridine

2、orange/ethidium bromide,AO/EB)雙染熒光顯微鏡和透射電鏡觀察細胞凋亡及用藥后細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的變化.用裸鼠制作人HCC模型觀察多烯紫杉醇在體內(nèi)對人肝癌生長抑制影響,以腫瘤生長延遲(absolute growth delay,AGD)時間即單純用藥組腫瘤從平均0.8cm到1.4cm所需要天數(shù)減去空白對照組達到

3、同樣大小所需要天數(shù)評價多烯紫杉醇的抗腫瘤效應(yīng).第二部分,多烯紫杉醇對人肝細胞肝癌(HCC)放療增敏實驗研究.目的:探討多烯紫杉醇在體內(nèi)外對人體HCC的放射增敏作用及其初步機制.方法:在體外用0.125nM、0.25nM、0.5nM多烯紫杉醇作用人SMMC-7721 HCC細胞株24小時和0.125nM、0.25nM、0.5nM多烯紫杉醇作用48小時后分別給予0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量照射,單純照射組未給予多烯紫

4、杉醇處理而接受同等照射劑量照射,用集落形成試驗分析多烯紫杉醇放射增敏效應(yīng).在體內(nèi)用裸鼠制作人HCC模型,當腫瘤生長至平均0.8cm時將它們隨機分組,分別為空白對照組、多烯紫杉醇單純用藥組、用藥加照射組、單純照射組.用藥加照射組給藥后24、48小時后分別在室溫下用<'137>Cs源按分割劑量照射局部腫瘤,每次分別給予5Gy,總劑量為10Gy,以校正過的生長延遲(NGD,normalized growth delay)時間即用藥加照射組腫瘤

5、從0.8cm到1.4cm所需要天數(shù)減去單純用藥組達到同樣大小所需要天數(shù)以及放射增敏因子(EF,enhancement factor)評價多烯紫杉醇的放射增敏效應(yīng).另外用流式細胞術(shù)檢測上述不同濃度多烯紫杉醇分別作用不同時間SMMC-7721細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和用比色法測定谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量的變化.第三部分,多烯紫杉醇對SSMC-7721細胞bcl-2和p21

6、基因表達的影響.目的:探討用不同濃度多烯紫杉醇作用于SSMC-7721細胞不同時間引起凋亡和細胞周期相關(guān)基因表達變化進一步在基因水平研究多烯紫杉醇生長抑制、誘導凋亡和放射增敏機制.方法:分別用10nM多烯紫杉醇處理SMMC-7721細胞6小時、12小時、24小時和用0.5nM多烯紫杉醇處理12小時、24小時、36小時,對照組不給任何藥物處理.實驗組和對照組細胞總RNA被抽提并被轉(zhuǎn)錄成cDNA.cDNA用Oligdt<,18>引物從3μg

7、 RNA合成.實時定量PCR檢測按照Light Cycler-DNA Master SYBER Green 1試劑盒使用說明操作.Bcl-2和p21基因用特殊寡核苷酸引物擴增,看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)也在同時用特殊引物擴增.所有DNA在Light Cycler基因擴增儀上按95℃ 0秒,65℃ 5秒,72℃ 10秒,40℃ 30秒共40個循環(huán)進行擴增.實時連續(xù)檢測基因擴增過程中所致熒光變化,以達到指數(shù)擴增時的循環(huán)周期