致腎盂腎炎大腸桿菌與細(xì)胞相互作用的初步研究.pdf

1、目的： 建立致腎盂腎炎大腸桿菌(pyelonephriticE.colioruropathogenicE.coli，UPEC)粘附細(xì)胞模型，了解細(xì)胞表面粘附受體分布情況，并檢測(cè)膀胱癌EJ細(xì)胞感染UPEC132后基因表達(dá)譜變化。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、人腎癌細(xì)胞系(Ketr-3細(xì)胞)、膀胱癌細(xì)胞系(EJ細(xì)胞)。比較UPEC132對(duì)此3種細(xì)胞的粘附能力。經(jīng)Giemsa染色觀察UPEC1

2、32粘附后不同細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)不同細(xì)胞的粘附率及粘附指數(shù)。并進(jìn)行UPEC132的侵襲試驗(yàn)，用慶大霉素殺死細(xì)胞外菌后計(jì)數(shù)胞內(nèi)菌，統(tǒng)計(jì)UPEC132對(duì)不同細(xì)胞的侵襲指數(shù)。同時(shí)比較無(wú)菌毛代表株E.coliK-12p678-54的粘附及侵襲能力。 2.運(yùn)用間接免疫熒光法檢測(cè)上述3種細(xì)胞表面的P菌毛受體，一抗選用抗P1抗體(小鼠單克隆抗體IgM)，二抗為FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的兔抗小鼠IgM抗體，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞

3、表面熒光特點(diǎn)，比較其受體分布情況。 3.基因芯片檢測(cè)膀胱癌EJ細(xì)胞感染UPEC132后基因表達(dá)譜變化。用Trizol提取EJ細(xì)胞總RNA(感染后細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，未感染細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組)，并對(duì)總RNA進(jìn)行濃縮、定量、質(zhì)檢，然后利用cRNA標(biāo)記方法對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，純化后用于芯片雜交；用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進(jìn)行芯片掃描，采用LuxScan3.0圖像分析軟件(CapitalBio公司)對(duì)

4、芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化；最后以差異為2倍的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。 結(jié)果： 1.UPEC132作用于上述3種細(xì)胞1h后，細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生了明顯改變：細(xì)胞間隙變大，胞漿突起收縮，甚至破裂，細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)皿的粘附能力也明顯下降。UPEC132對(duì)Vero、Ketr-3及EJ細(xì)胞的粘附率分別為(61.44±3.21)％、(55.22±4.09)％及(58.67±5.1

5、2)％，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)此3種細(xì)胞的粘附指數(shù)分別為1.44±0.06、1.74±0.09和2.27±0.18，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。UPEC132對(duì)EJ及Ketr-3細(xì)胞的侵襲指數(shù)分別為(3.25±0.20)×10-3、(3.00±0.34)×10-3，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均高于對(duì)Vero細(xì)胞的侵襲指數(shù)[(2.61±0.32)×10-3，p<0.05]。E.coliK-12p678-54對(duì)上述3種細(xì)胞無(wú)粘附及侵襲能力，細(xì)

6、胞形態(tài)未見改變。 2.熒光顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面呈黃綠色熒光，細(xì)胞輪廓清晰，熒光物質(zhì)在細(xì)胞表面呈連續(xù)性分布。而對(duì)照組未見細(xì)胞表面熒光。提示此3種細(xì)胞表面存在P菌毛受體。 3.膀胱癌EJ細(xì)胞感染UPEC132后的基因表達(dá)譜檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)29個(gè)差異表達(dá)基因，其中28個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，這些差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，表明UPEC132粘附EJ細(xì)胞后在多靶點(diǎn)、多層