Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏BMDCs瘤苗抗腫瘤免疫效應的研究.pdf

1、腫瘤微環(huán)境是腫瘤逃避免疫排斥和促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個重要保護屏障，也是腫瘤免疫治療的一個瓶頸。腫瘤微環(huán)境構成一個復雜的網(wǎng)絡:①腫瘤MHC、HLA、Fas分子、TSA、TAA等的表達改變或缺失;②腫瘤上調分泌IL-10、TGF-β1等免疫抑制細胞因子，下調分泌IL-2、IFN-γ等免疫效應細胞因子;③免疫抑制功能的調節(jié)T細胞(Tregs)在瘤內浸潤增多④樹突狀細胞(DCs)功能不全或處于未成熟狀態(tài)⑤熱休克蛋白(HSPs)表達異常。Tre

2、gs的免疫抑制、DCs功能不全、HSPs異常表達對腫瘤微環(huán)境有重要的影響作用:1）Tregs特別是CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤增多促進腫瘤免疫抑制。叉頭轉錄因子p3(Foxp3)在Tregs的活化與功能起到關鍵的作用，腫瘤分泌的細胞因子TGF-β、IL-10促進CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs在腫瘤浸潤:TGF-β誘導和維持CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的抑制功能，誘導周圍淋巴器官CD4

3、+ CD25-T細胞反轉為抑制型CD4+ CD25+T細胞;IL-10誘導CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs增殖。CD4+ CD25+ Foxp3+Tregs通過細胞直接接觸或分泌細胞因子①抑制CD4+T細胞、CD8+T的活化、增殖;②抑制B細胞的增殖、抗體產生和類型轉換，③抑制NK細胞、NK T細胞的細胞毒性，④抑制DCs的成熟。2）腫瘤浸潤的DCs，大部分為未成熟DCs(iDCs):①抗原呈遞能力低;②與CD4+ CD2

4、5+ Foxp3+ Tregs相互作用抑制免疫;③下調表達共刺激分子CD80、CD86;④上調表達ICOS、ILT3、ILT4與T細胞相應受體結合誘導初始T淋巴細胞轉變?yōu)門regs。3）腫瘤上調表達HSPs通過細胞保護和抑制調亡影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移。
　　DCs是體內最有效的專職抗原遞呈細胞，具有攝取、加工抗原，以MHC-Ⅰ、Ⅱ類肽結合的形式提呈抗原的能力。用不同的方式刺激DCs制成腫瘤疫苗已證實有抗腫瘤效應，本課題利

5、用Hepal-6細胞裂解蛋白的全抗原性，結合熱休克后提高HSPs表達，增強其免疫性。Hepal-6細胞熱休克后提取蛋白致敏骨髓樹突狀細胞(BMDCs)制成瘤苗，體外研究瘤苗的抗腫瘤效應;將瘤苗注射荷瘤小鼠，觀察瘤苗的體內抗腫瘤效應。
　　主要方法和實驗路線：
　　1.建立荷瘤小鼠模型，分離和鑒定小鼠脾、淋巴結和腫瘤內CD4+CD25+ Foxp3+ Tregs，F(xiàn)ACS分析瘤內CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞

6、，CD86+細胞的浸潤。免疫組化(IHC)和western-bolt分析腫瘤內Foxp3、HSP70和HSP90的表達情況;Hep-6細胞熱休克并提取蛋白。
　　2.培養(yǎng)、誘導和鑒定C57BL/6J小鼠的BMDCs，并做成熟刺激實驗;Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏BMDCs，分析刺激后BMDCs的CD11c、CCR7、CD80、CD86表達，IFN-γ的分泌，體外對T細胞的增殖效應和CTL作用，以及對Hepa-6細胞凋亡的

7、影響。
　　3.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗足墊和瘤內注射荷瘤小鼠，研究瘤苗對腫瘤的生長抑制;對瘤內免疫效應CD4+T細胞、CD8+T細胞活化和增殖效應;對CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞和CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤的影響;對瘤內免效應細胞因子和免疫抑制因子的影響;治療后腫瘤組織內HSPs分子的表達改變。
　　主要結果：
　　1.FACS

8、檢測結果顯示，小鼠瘤內有較多的CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤，荷瘤小鼠脾和淋巴結的Foxp3+ Tregs浸潤增多;瘤內有CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞浸潤;IHC和western-bolt檢測結果示，瘤體內表達HSP70、HSP90、Foxp3+蛋白。Hepal-6細胞熱休克后，能上調表達HSP70。
　　2.GM-CSF和IL-4誘導的BMDCs具有DCs表型，表達CD11c、CCR

9、7、CD80、CD86等DCs相關分子;Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs上調表達CD11c、CCR7、CD80、CD86。
　　3.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs上調IFN-γ的分泌，向SLC趨化遷移的能力提高;體外能刺激T細胞的增殖，能促進T細胞的CTL效應;能促進Hepal-6細胞的凋亡。
　　4.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤內和足墊注射荷瘤小鼠后，平均瘤體體

10、積和重量低于對照組;CD8+T細胞和CD4+T細胞在脾、淋巴結和腫瘤的浸潤增多，瘤內CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞數(shù)量上升;腫瘤、脾、淋巴結內CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg浸潤減少;腫瘤、脾、和淋巴結Foxp3分子表達下調;腫瘤內免疫抑制因子IL-I0、 TGF-β1分泌下調;免疫效應因子IL-2、IFN-γ分泌上調;初步檢測的結果顯示瘤內HSP70在治療前后改變不明顯。
　　結論：

11、
　　熱休克能提高Hepal-6細胞HSPs表達，裂解蛋白體外致敏的BMDCs上調表達CD11c、CCR7、CD80、CD86分子;上調IFN-γ的分泌，遷移能力增強。裂解蛋白致敏的BMDCs體外能刺激T細胞的增殖，增強T細胞的CTL效應，對Hepal-6細胞的凋亡有促進作用。致敏的BMDCs疫苗瘤內注射后，能抑制腫瘤的生長;抑制免疫抑制細胞CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs在腫瘤、脾和淋巴結的浸潤;下調免疫抑制細胞因

12、子IL-10、TGF-β在腫瘤的分泌，上調免疫效應細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌;促進CD11c+ DCs在瘤內浸潤和成熟，促進CD4+T細胞、CD8+T細胞在脾、淋巴、腫瘤結內浸潤。因此，Hepal-6熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗能優(yōu)化腫瘤微環(huán)境的T細胞種群，促進瘤內CD11+c DCs的浸潤和成熟，改善微環(huán)境的免疫條件，促進腫瘤的免疫排斥，但是否對瘤內HSPs的表達有影響尚待實驗進一步研究。
　　創(chuàng)新點：
　

13、　本研究的創(chuàng)新之處在于，利用腫瘤細胞裂解蛋白的全抗原，通過熱休克提高HSPs的表達，提高腫瘤細胞免疫原性;提高BMDCs抗原遞呈;減少免疫抑制細胞Tregs的浸潤;促進CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK T細胞的活化和增殖;促進免疫效應細胞因子的分泌;抑制免疫抑制因子的分泌。
　　問題和展望：
　　由于HSPs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中扮有重要角色，本研究通過熱休克提高腫瘤細胞HSPs表達，熱休克后提取的蛋白能促