丹參PPAR-α受體激動效應的體外研究.pdf

1、一、目的 構建人PPAR-α受體的重組表達質粒，基于PPAR-α受體的信號傳遞通路和利用雙螢光素酶報告基因分析方法，建立穩(wěn)定的PPAR-α激動劑體外篩選體系，研究丹參不同組分及部分單一成分的PPAR-α激動效應，探討丹參抗動脈粥樣硬化的作用機理。 二、方法 1.構建重組質粒1.1 PPAR-α蛋白表達質粒從基因庫獲取人PPAR-α基因(GeneBank：NM_005036)蛋白編碼區(qū)全長序列(CDS：267..1

2、673)，依照引物設計原則及編碼序列上已有酶切位點設計引物并添加酶切位點；從正常肝組織細胞提取總RNA，逆轉錄得eDNA，PCR擴增目的片段，克隆到pcDNA3.1真核表達載體，測序鑒定重組質粒目的基因蛋白編碼區(qū)全長序列及開放閱讀框的正確性，命名為pcDNA-hPPAR-α。 1.2螢光素酶報告質粒合成PPRE反應元件3倍重復序列5’-CAGGTCACTGGTCACAGGTCAG-3’，克隆到蟲螢光素酶報告質粒pGL3 prom

3、oter Vector多克隆位點，測序鑒定插入片斷序列的正確性，命名為pGL3-PPRE-luc。 2.丹參不同提取組分的制備取丹參原藥材粉末50g于1000mL燒瓶中加水500mL，超聲1hr，過濾，重復操作，合并兩次濾液，低溫負壓干燥，干燥產(chǎn)物懸于200mL80％甲醇中，過濾，濾渣為產(chǎn)物SMI，濾液低溫負壓干燥，得產(chǎn)物SM2：上步水提濾渣加甲醇500mL，超聲1hr，過濾，重復操作，合并兩次濾液，低溫負壓干燥，干燥產(chǎn)物懸于2

4、00mL乙酸乙酯中，過濾，濾渣為產(chǎn)物SM3，濾液低溫負壓干燥，得產(chǎn)物SM4。 3.瞬時轉染及報告基因分析設丹參提取物組：SM1、SM2、SM3、SM4，單一成分組：丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮，非諾貝特陽性對照組及空白對照組，pcDNA-hPPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV載體共轉染297T細胞6小時后，各組加相應試驗溶液對轉染細胞進行干預，試驗液終濃度，提取物組為0.1、1、10、50μg/mL，單

5、一成分及非諾貝特組為0.1、1、10、50μM，常規(guī)培養(yǎng)24小時后測定螢光素強度，計算相對螢光素酶表達強度。 三、結果 1.重組質粒的構建核酸測序結果表明：所得pcDNA-hPPAR-α的蛋白編碼全長序列與基因庫一致，正向插入載體pcDNA3.1多克隆位點Nhe I和Kpn I之間，開放閱讀框正確。pGL3-PPRE-luc測序結果表明：插入的PPRE反應元件片段序列正確，位置在Kpn I，Nhe I多克隆位點之間。

6、 2.丹參提取產(chǎn)物制得產(chǎn)物SM1、SM2、SM3、SM4、色澤均勻，產(chǎn)量分別為1.5、9.6、2.5、1.0g。 3.丹參組分的PPAR-α體外激動效應丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮、SM1、SM2、SM3、SM4對報告基因的相對誘導率均小于1.06，與空白組比較無顯著差異，而濃度為0.1、1、10、50μM的非諾貝特陽性組相對誘導率分別為：0.82、1.29、1.72、1.94，表現(xiàn)有顯著差異。 四、結論

7、 成功構建重組質粒pcDNA-hPPAR-α和pGL3一PPRE-luc；非諾貝特陽性試驗結果表明：成功建立基于PPAR-α信號通路及雙螢光素酶報告基因分析方法的PPAR-α激動劑篩藥系統(tǒng)；經(jīng)篩藥體系的體外研究，四種丹參主要活性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮無顯著的體外PPAR-α激動活性，在確保篩藥體系活性的給藥濃度下丹參四種不同提取組分無顯著的體外PPAR-α激動作用；丹參中是否存PPAR-α激動成分，其確切的抗動脈粥樣硬