維生素E在藍光誘導人視網(wǎng)膜色素上皮細胞復制衰老中的作用.pdf

1、目的：復制衰老是正常人體細胞在體外分裂潛能受限制的現(xiàn)象，是細胞的一種存在形式，在眼部可能與多種年齡相關性疾病有關。本研究目的是觀察一定波長下不同強度的藍光對培養(yǎng)人(RPE)細胞中衰老相關β一半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性的作用，及不同濃度的維生素E(VitE)對復制衰老細胞的作用，為進一步研究老年性黃斑變性(AMD)等眼部病變與復制衰老的關系提供依據(jù)。 方法：1.人RPE細胞的體外培養(yǎng)以因意外死亡的新鮮人眼球為材料，采用胰蛋

2、白酶消化法進行RPE細胞的原代培養(yǎng)，鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，以免疫組織化學方法進行細胞鑒定。待細胞基本融合后，將細胞以1:2～1:3傳代，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每4～7天傳代，觀察細胞的生長狀態(tài)，描記生長曲線。2.藍光誘導RPE細胞復制衰老和VitE的作用取生長良好的人RPE細胞，自第2代開始在培養(yǎng)液中加入VitE，使不同分組培養(yǎng)液中VitE終濃度分別為100μmol/L、50μmol/L、10μmol/L和

3、0；給予波長450nm～500nm，細胞表面水平光照度分別為(2000±500)lux、(1000±200)lux、(500±100)lux和0的分組光照，每天光照1小時。在此基礎上各組細胞正常培養(yǎng)傳代至第5代，并觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)。將不同光照處理后的第5代細胞接種于24孔板，培養(yǎng)24小時，固定30分鐘，0.1％TritonX-100室溫下作用20分鐘，加入SA-β-Gal檢測液，室溫、避光，顯色24小時，高倍鏡下觀察細胞中是否有藍

4、色顆粒的表達；將各組不同光照強度處理后的細胞接種于96孔板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，每孔加入DMSO150μl，微型振蕩器振蕩10分鐘，600nm測定光密度(opticaldensity，OD)值。3.統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件后進行雙因素方差分析，用SNK法進行多重比較。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。 結果：1.人RPE細胞形態(tài)特征原代細胞24～48小時后基本能夠

5、貼壁并變得扁平，4～5天后貼壁細胞會伸出偽足，呈不規(guī)則多角形，中央的圓形透明區(qū)域為細胞核，可見到處于分裂期的雙核和多核細胞以及呈集落生長的細胞團。免疫組織化學檢測呈陽性反應，胞漿被染成棕黃色。5～10天原代細胞基本融合。隨傳代次數(shù)增加，胞漿中的黑色素顆粒逐漸減少，漸趨于透明。復制衰老人RPE細胞體積增大，胞體變平，多數(shù)細胞失去多角形態(tài)，長的細胞突起增多。經(jīng)SA-β-Gal活性染色，復制衰老細胞被染成淡藍色。2.藍光誘導復制衰老及VitE

6、的抑制復制衰老作用SA-β-Gal活性檢測：隨光照強度增加和VitE濃度降低，細胞SA-β-Gal染色陽性率升高。不同光照強度之間F=20.76(P<0.01)，各光照強度作用效果差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：不同VitE濃度之間F=16.76(P<0.01)，各濃度作用效果除10μmol/L組與無VitE組(P>0.05)外差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTT檢測：隨光照強度增加和VitE濃度降低，細胞增殖能力有降低趨

7、勢。不同光照強度之間F=10.26(P<0.01)，其中(2000±500)lux、(1000±200)lux、(500±100)lux三組0D值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，無光照組OD值和這三組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同VitE濃度之間F=27.27(P<0.01)，各濃度作用效果除100μmol/L組與50μmol/L組(P>0.05)外差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論：1.應用本實驗的