載銀介孔氧化硅新型納米菌材料體外抗菌性能及生物相容性能的實驗研究.pdf

1、第一部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料抗菌性能研究
　　背景:載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)材料生物相容性好，機械性能佳，具有載藥潛力及可控緩釋藥物能力，可望成為良好的骨替代材料抗菌載藥顆粒。
　　目的:本實驗通過對該材料的體外抗菌性能及Ag+緩釋特點進行研究，探討其應用于填充慢性骨髓炎術(shù)后骨缺損的可行性。
　　方法:采用標準肉湯稀釋法及OD600細菌生長曲線測定法檢測不同濃度的Ag-MSN混懸液及MSN混懸液對于金葡

2、菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌/脆弱擬桿菌和白色念珠球菌的體外抗菌效果。將Ag-MSN混懸液分別浸泡于50 ml模擬體液(simulated body fluid，SBF)中，于3h/6h/12h/1d/3d/7d/10d/14d采用火焰原子吸收光譜法檢測Ag+濃度，繪制銀離子釋放曲線，檢測材料的Ag+緩釋特點。
　　結(jié)果:Ag-MSN對于金葡菌/銅綠假單胞菌/大腸桿菌/脆弱擬桿菌的最小抑菌濃度(MIC)均≤200μg/ml，而最小殺

3、菌濃度(MBC)則分別為400/200/200/200μg/ml，中間濃度材料浸提液相對于對照組能顯著抑制細菌生長;但材料對于真菌——白色念珠球菌無明顯殺菌效果，在400μg/ml濃度下僅能抑制其生長;Ag-MSN各濃度組SBF浸泡液中的銀離子總釋放趨勢基本一致，均于浸泡6小時后達到銀離子釋放的峰值，浸泡3d后銀離子釋放漸趨穩(wěn)定，與浸泡14天內(nèi)無明顯差異400，200組在14天內(nèi)均維持在銀離子生物安全濃度與最小抑菌濃度MIC之間。

4、>　　結(jié)論:載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)材料在體外對金黃色葡萄球菌/大腸桿菌/銅綠假單胞菌/脆弱擬桿菌有明顯抗菌作用，對于白色念珠球菌有抑菌作用。其在SBF中具有良好的緩釋效果，有望成為針對慢性骨髓炎的良好的新型骨替代材料抗菌載藥顆粒。
　　第二部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料對于成骨樣細胞增殖分化能力的影響
　　目的:檢測不同濃度載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅納米顆粒浸提培養(yǎng)液的細胞毒性，及其對成骨樣細胞增

5、殖分化能力的影響，探討其生物相容性及將來應用于填充慢性骨髓炎術(shù)后骨缺損的可行性。
　　方法:采用CCK8法檢測不同濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液對于成骨樣細胞的細胞毒性及對其增值能力的影響。分別于共培養(yǎng)1，3，7天時采用ELISA法檢測與不同組別浸提培養(yǎng)液共培養(yǎng)后的成骨樣細胞的堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(OC)的蛋白分泌量。實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(OC)基因表達的變化。

6、
　　結(jié)果:在檢測的3個時間點下，4組不同濃度的Ag-MSN材料浸提液與MSN浸提液培養(yǎng)下的成骨樣細胞生長良好，各實驗組與對照組的細胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，各實驗組均未抑制成骨樣細胞的增殖功能。細胞毒性CTS分級均為0-1級，未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。成骨樣細胞在不同濃度的Ag-MSN及MSN浸提培養(yǎng)液培養(yǎng)下與對照組的成骨樣細胞一樣，ALP活性隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，高濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液能提高

7、ALP的基因表達和蛋白分泌量及OC基因的表達，與對照組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，但對BGP蛋白分泌量則無明顯影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論:Ag-MSN與MSN均有較好的生物相容性，無細胞毒性。同時Ag-MSN與MSN浸提培養(yǎng)液均有一定的骨誘導作用。
　　第三部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料對于成骨樣細胞OPG/RANKL通路的影響
　　目的:檢測不同濃度載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅納米顆粒浸提培

8、養(yǎng)液對成骨樣細胞破骨細胞分化相關(guān)通路---OPG/RANKL通路的影響，在體外實驗中從分子蛋白水平探討材料是否會通過OPG/RANKL通路影響骨重建。
　　方法:采用不同濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液作為檢測液體與成骨樣細胞共培養(yǎng)。分別于共培養(yǎng)1，3，7天時采用實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測OPG, RANKL基因表達的變化。采用Western Blot法檢測與不同組別浸提培養(yǎng)液共培養(yǎng)后的成骨樣細胞細胞內(nèi)的

9、護骨素(OPG)與破骨細胞分化因子（RANKL）蛋白分泌量的變化趨勢。
　　結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果顯示，各實驗組與對照組的OPG基因表達量自第3天開始逐漸升高，其后一直維持在較高水平，各實驗組與對照組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。而RANKL的基因表達量在共培養(yǎng)第7天著升高，對照組與各實驗組均表現(xiàn)了這一特性，組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，共培養(yǎng)7天后，各實驗組及對照組成骨樣細胞中OPG蛋白

10、量無明顯差異，但實驗組的RANKL蛋白表達量較對照組有輕度升高，其中高濃度的400μg/ml Ag-MSN組與400μ g/ml MSN組升高較為明顯，有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:在體外共培養(yǎng)的早期，即成骨樣細胞分化至成熟階段，Ag-MSN與MSN對于成骨/破骨細胞間的OPG/RANKL通路無明顯影響，但在成骨樣細胞成熟期，高濃度的Ag-MSN及MSN會通過增加成骨細胞RANKL蛋白的表達進而輕度活化破骨細胞。但其是否在體內(nèi)通過這一