牛支原體病學(xué)的免疫分析.pdf

1、牛支原體是一種在世界范圍內(nèi)廣泛存在的重要病原，主要引起肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎等，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，由于牛支原體蛋白抗原特征不明確，使免疫學(xué)方法控制牛支原體病存在著巨大的困難。本論文通過(guò)免疫蛋白組學(xué)、免疫信息學(xué)、基因表達(dá)和免疫學(xué)方法對(duì)牛支原體的抗原特征進(jìn)行了全面評(píng)估。從中國(guó)臨床分離株 HB0801提取全菌蛋白及用 TX-114提取膜蛋白進(jìn)行雙向電泳，利用牛支原體臨床感染犢牛的陽(yáng)性血清與蛋白反應(yīng)后，通過(guò) MALDI-TOF M

2、S質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了分析，共鑒定了39個(gè)抗原蛋白，其中32個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的抗原蛋白。其中8個(gè)有反應(yīng)原性的蛋白通過(guò)進(jìn)一步的免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)具有很高的免疫原性，分別由基因 Mbov_0106，0116，0126，0212，0275，0579，0739和0789編碼。通過(guò)重疊延伸 RCR定點(diǎn)突變技術(shù)將牛支原體中編碼色氨酸的密碼子UGA突變?yōu)樵诖竽c桿菌中表達(dá)色氨酸的密碼子 UGG，然后構(gòu)建重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中表達(dá)蛋白，制備鼠源的多克隆抗體。結(jié)果表明 M

3、bov_0579基因編碼的MbovP579脂蛋白是一個(gè)穩(wěn)定、敏感、特異的抗原，能用于檢測(cè)自然感染或疫苗免疫的牛。其特異性通過(guò)與其同源性最高的無(wú)乳支原體、大腸桿菌、鼻氣管炎病毒、流行性腹瀉病毒蛋白的無(wú)交叉反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證。Mbov_0579是一個(gè)功能未知的基因，在無(wú)乳支原體和其他病原菌中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其同源基因，因此，rMbovP579蛋白適于建立間接ELISA方法。測(cè)定其ROC曲線分析閾值為0.442，此方法能對(duì)在感染后7天檢測(cè)到血清反應(yīng)，且對(duì)于

4、臨床樣品的敏感性為90.2％（95％CI：83.7％，94.3％），特異性為97.8（95％CI：88.7％，99.6％）。其他比較研究表明這種ELISA的診斷和分析靈敏度都顯著高于商品化試劑盒（p<0.01）。
　　另外，TX-114提取的M. bovis HB0801株膜蛋白和M. bovis-150株膜蛋白通過(guò)雙向電泳、免疫印跡、MALDI-ToF和 LC-MS/MS技術(shù)分析鑒定出19個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中12個(gè)蛋白通過(guò)MAL

5、DI-ToF質(zhì)譜鑒定，另外7個(gè)通過(guò)鳥(niǎo)槍法LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定。通過(guò)熒光定量 PCR方法鑒定出7個(gè)差異表達(dá)蛋白與雙向電泳鑒定的出的蛋白趨勢(shì)保持一致?？偨Y(jié)：本研究發(fā)現(xiàn)了牛支原體的一個(gè)新的抗原蛋白 MbovP579，并建立了特異性和敏感性良好的適合早期診斷的間接 ELISA方法。此外，通過(guò)免疫蛋白質(zhì)組學(xué)和 MALDI-ToF和LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)了2個(gè)抗原脂蛋白（由Mbov_0730和Mbov_0732編碼）可以作為分子標(biāo)