丹參酮ⅡA對人食管癌細胞系Eca-109增殖抑制作用及機制研究.pdf

1、研究背景;
　　據(jù)報道，在我國每年死于食管癌的人數(shù)約為21萬人，男性人數(shù)多于女性，40歲以上的發(fā)病率高，它嚴重威脅著我國人民的健康和生命[1]。其治療方法主要有手術(shù)切除、腫瘤的放療和化療等，單一的任何一種方法都不是理想的，因此多采用綜合治療，在手術(shù)切除后配合藥物化療。現(xiàn)在的化療新藥層出不窮，但因化療產(chǎn)生的副反應(yīng)仍然較大，并且耐藥性不斷增加，病人的的5年存活率依然很低。因此，利用我國的優(yōu)勢，研究中藥及其提取的有效成分在腫瘤治療方面的

2、作用是以后發(fā)展的方向之一。本研究探討了食管癌可能的發(fā)生機制及中藥丹參中的揮發(fā)油-丹參酮ⅡA（TanⅡA）對人食管癌細胞株Eca-109的作用。
　　Ta nⅡA是中藥丹參的主要成分。丹參酮在臨床上已被廣泛應(yīng)用于非腫瘤領(lǐng)域，主要用來治療心血管疾病，在抗菌消炎等[1]方面也有顯著療效。近年來，學者對丹參酮IIA的抗腫瘤活性產(chǎn)生了極大興趣，并進行了多種腫瘤細胞的體內(nèi)外試驗，但對食管癌的抗癌作用卻鮮見報道。
　　目的；
　　通

3、過對人食管癌Eca-109細胞的培養(yǎng)，用不同濃度的TanⅡA干預其生長，運用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，探討 TanⅡA促進 Eca-109細胞凋亡的機制，為 TanⅡA更深入的研究做準備。
　　方法：
　　1．MTT法：通過培養(yǎng)人食管癌Eca-109細胞，用不同劑量的TanⅡA作用于Eca-109細胞，通過四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）測定各組的吸光值（OD值），并計算出各組細胞的增殖抑制率，繪制增殖抑制率曲線。
　　2．顯微

4、形態(tài)觀察：藥物組細胞和正常組細胞培養(yǎng)24小時后，在顯微鏡下觀察正常細胞和藥物干預細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。
　　3．細胞熒光觀察：藥物組細胞和正常組細胞培養(yǎng)24小時后，應(yīng)用AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察兩組細胞的形態(tài)變化。
　　4．流式細胞術(shù)：采用140μg/ml、160μg/ml的TanⅡA干預細胞生長24和48小時，設(shè)置陰性對照，用流式檢測細胞周期和細胞凋亡。
　　5．免疫蛋白印跡法：采用140μg/ml、16

5、0μg/ml的TanⅡA干預細胞生長24小時，提取細胞的總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，采用蛋白免疫印跡技術(shù)（western blot）檢測Caspase-3、Caspase-9、CyclinA和CDK2的表達，以β-actin作為內(nèi)參，用BIO-RAD軟件分析條帶的灰度值。
　　結(jié)果：
　　1．MTT檢測結(jié)果顯示：正常組細胞活力明顯高于藥物組，并且在一定的范圍內(nèi)，隨藥物的濃度增加，細胞的活力下降，最高的抑制率可達66.16

6、4％，與陰性對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。
　　2．顯微鏡觀察顯示：經(jīng)過 Ta nⅡA處理后的細胞與正常組細胞相比較，藥物組細胞有明顯的凋亡形態(tài)的改變，出現(xiàn)細胞漂浮，細胞核固縮，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞出現(xiàn)“小泡”現(xiàn)象。
　　3．細胞熒光觀察結(jié)果顯示：與正常組細胞相比較，藥物組細胞出現(xiàn)核染色質(zhì)著綠色或紅色并呈固縮狀、圓珠狀。
　　4.流式結(jié)果表明：1)140μg/ml TanⅡA干預 Eca-109細胞24小時

7、后，結(jié)果顯示 S期的細胞數(shù)升高，達到54.47%；同時 G0/G1期的細胞數(shù)下降，由51.317%降至41.787%，與陰性對照相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。2)采用140μg/ml和160μg/ml的TanⅡA培養(yǎng)細胞24小時，結(jié)果顯示藥物組凋亡指數(shù)隨著藥物濃度的增加，凋亡指數(shù)增大，由陰性的8.319增加到TanⅡA140、160μg/ml組的31.982和52.937。用藥組和陰性對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0

8、.01）。
　　5.Western blot結(jié)果顯示：藥物培養(yǎng)24小時后，細胞內(nèi)CyclinA、CDK2表達量降低；Caspase-3、Caspase-9的表達量上升，和正常組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．TanⅡA可以抑制人食管癌細胞的增殖活力，并且這種抑制作用隨藥物濃度的增加會更明顯。
　　2．在 TanⅡA作用于食管癌細胞系 Eca-109的過程中，隨著藥物濃度的升高，細