人臍血間充質干細胞移植治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷的研究.pdf

1、研究背景 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-isehemic brain damage，HIBD)是造成兒童智能傷殘的主要原因之一。目前對缺氧缺血性腦損傷后修復治療是一個尚未解決的世界性難題。源于胚胎組織的神經干細胞(neural stem ceHs，NSC)曾被認為是治療中樞神經系統(tǒng)疾病的希望，但因其利用來源的缺乏和倫理道德的約束而受到明顯的限制。近期文獻報道，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchy

2、mal stem ceils，BM-MSCs)作為一種多潛能干細胞，在體外一定條件下可向骨、肌肉、肝臟、神經膠質細胞和神經元分化，骨髓MSCs移植已用于多種疾病的實驗研究。但是，骨髓來源的MSCs因其有被病毒污染的可能和隨著年齡的增長細胞數(shù)量及擴增和分化的能力均明顯下降等特點，它作為種子細胞用于移植治療的能力也因此受到極大的限制。故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補其缺陷的干細胞來源是非常必要的。 已有研究表明，人臍血(hu

3、man umbilical cord blood，HUCB)中含有豐富的造血干細胞/祖細胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitor cell，HSC/HPC)，臍血中的造血干細胞/祖細胞已成功的用于臨床的異體細胞移植治療。但有關臍血中是否含有MSCs目前仍有爭議。有一些學者認為在正常足月生產的胎兒臍血中不存在MSCs，或認為在足月分娩的臍帶血中MSCs的含量極低，而不能滿足實驗和

4、臨床的需要。近年來許多研究證實，從臍血中可成功培養(yǎng)出MSCs，且臍血MSCs具有與骨髓MSCs相似的性質，具有較強的可塑性和多向分化潛能，臍血MSCs在體外特定的條件下可定向分化為神經元和神經膠質細胞。臍血MSCs移植治療在缺氧缺血性腦損傷和腦脊髓損傷的動物實驗中，觀察到移植細胞在腦組織內神經元和神經膠質細胞標志物的表達和神經功能的恢復。 已有的臍血MSCs移植實驗大多針對于成年動物缺氧缺血性腦損傷和局灶性腦外傷模型的研究，但對

5、新生動物移植研究較為少見；而且，其移植途徑多為顱內和腦室內移植，此易造成額外的腦損傷。研究表明，新生宿主與成年宿主對干細胞移植存在著許多差異。未成熟腦處于快速發(fā)育時期，腦內含有較成年宿主更多的神經分泌細胞，故新生宿主腦組織具有MSCs移植后增殖、分化、遷移與整合的兼容環(huán)境。動物實驗顯示，新生宿主移植神經干細胞在腦內遷移較成年宿主廣泛，定向分化能力較強；新生宿主血腦屏障未發(fā)育成熟，處于“相對開放”狀態(tài)，研究證實移植細胞可通過新生動物的血腦

6、屏障進入腦內，提示可選擇外周靜脈移植；新生宿主免疫機能不完善，故發(fā)生移植相關性移植物抗宿主疾病(g～raft-versus-host disease，GVHD)較少，異體移植成功率較高?？傊律拗髦袠猩窠浵到y(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育的特點決定了其接受臍血MSCs移植將會有令人更加振奮的效果。 目的 本研究首先論證在足月正常生產的胎兒臍帶血中是否可分離出MSCs，探索在體外培養(yǎng)、純化和擴增臍血MSCs的方法；研究臍血MSCs

7、的生物學特性，并進一步誘導臍血MSCs向神經元和神經膠質細胞分化。然后，分別通過腦內海馬部位移植和腦損傷后不同時間血液移植人臍血MSCs治療HIBD新生大鼠，觀察臍血MSCs移植對HIBD新生大鼠的神經功能的恢復及移植細胞在腦組織內的分化情況，以探討臍血MSCs移植治療新生大鼠HIBD的療效及外周血液移植的可行性，為進一步進行臍血MSCs移植治療新生兒HIBD的臨床應用，及選擇最佳移植途徑和治療時間提供實驗基礎和理論根據。 方法

8、 1、人臍血MSCs的體外培養(yǎng)和生物學特性研究 無菌條件下采取健康育齡產婦正常足月分娩胎兒的臍帶血38份臍血，采用常規(guī)的骨髓MSCs培養(yǎng)法(Friedenstein法)進行細胞培養(yǎng)。密度梯度離心法分離臍血單個核細胞(mononuclearcells，MNCs)，單個核細胞以l×10<'8>cells/ml密度接種在FCS預包被的F25培養(yǎng)瓶中，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(PH值為713)5ml，將培養(yǎng)

9、瓶置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5％CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后全量換液，去除未貼壁細胞，后每3d全量換液。待細胞生長至80％-90％融合，按1：2的比例以1×10<'6>cells/ml密度接種進行傳代培養(yǎng)。取P3代MSCs用流式細胞儀檢測MSCs的免疫表型CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD106的表達。 2、人臍血MSCs向神經細胞誘導分化的實驗 取P3代臍血MSCs進行體外誘導分化實驗

10、，分為三組：①化學因子誘導，先用含有3mmol/Lβ-疏基乙醇的DMEM/F12(含20％FCS)培養(yǎng)液預誘導24h，換成含20g/L二甲基亞砜(DMSO)和200mmol/L丁化羥基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM/F12進行誘導培養(yǎng)；②生長因子誘導，含20％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growt

11、h factor，bFGF) (終濃度均為各10ng/ml的)誘導分化劑誘導培養(yǎng)臍血MSCs；③神經培養(yǎng)液(HIBD新生sD大鼠腦組織培養(yǎng)上清液)+生長因子誘導(加入含EGF和bFGF終濃度均為各10ng/ml的誘導分化劑)誘導培養(yǎng)臍血MSCs，與神經培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導對照。各組取細胞爬片，通過免疫細胞化學染色檢測誘導后的細胞神經干細胞標記物Nestin、神經元標志物MAP<,2>和神經膠質細胞標志物GFAP的表達。 3、人臍血M

12、SCs移植治療新生大鼠HIBD的研究 7日齡SD大鼠經左側頸總動脈結扎后，予8％氧氣和92％氮氣低氧處理2h，建立HIBD動物模型。假手術組(Sham組，n＝12)，62只HIBD新生大鼠隨機分為5組：假移植組(n＝12)，腦內移植組(n＝13)，血液移植Ｉ組(n＝13，心內穿刺時死亡3只)，血液移植Ⅱ組(n＝12)和血液移植Ⅲ組(n＝12)。移植前用熒光染劑DAPI染色標記臍血MSCs。腦內移植組于缺氧缺血(hypoxia-

13、ischemia，HI)后24h左側海馬部位腦內注射MSCs懸液20ul；血液移植Ⅰ組(因新生大鼠無法建立外周血管途徑，選擇心內注射移植)，于HI后24h心內注射MSCs懸液20ul；血液移植Ⅱ組和血液移植Ⅲ組分別于HI后7d、14d尾靜脈注射臍血MSCs懸液20ul。每組分別于生后3w、5w進行Y型迷宮試驗評價其學習記憶能力；于生后3w、5w行多聚甲醛灌注取腦，制備腦組織切片，并分別行HE染色和免疫組織化學熒光檢測MAP<,2>、GF

14、AP細胞標記。結果 1、人臍血MSCs的體外培養(yǎng)和生物學特性研究結果 38份臍血中單個核細胞原代培養(yǎng)，18 份觀察到MSCs樣細胞生長，其中僅6份傳代培養(yǎng)成功，20份培養(yǎng)細胞以大的扁圓形細胞破骨細胞為主，但不能傳代。原代和第3代臍血MSCs的生長特性進行觀察比較，原代MSCs在接種后的2-5d為生長的潛伏期；10-14d以后細胞進入對數(shù)生長期，3-4周左右逐漸進入平臺期；P3代臍血MSCs擴增速度明顯快于原代培養(yǎng)，2

15、-4d倍增1次，5-8d后細胞進入到對數(shù)生長期，10-14d進入平臺期。通過流式細胞儀檢測第3代的臍血MSCs結果顯示，P3代MSCs不表達或極弱表達CD34、CD45、CDI06造血細胞標志，穩(wěn)定地高表達CD29、CD44、CD105間充質細胞相關的表面抗原標記。這與骨髓MSCs的表面抗原標志相一致。表明臍血MSCs是存在于臍血中區(qū)別于造血細胞的一群處于未分化狀態(tài)的非定向干/祖細胞。 2、人臍血MSCs的向神經細胞誘導分化的實

16、驗結果 臍血單個核細胞及P3代MSCs在未培養(yǎng)和誘導前均存在著Nestin、MAP<,2>的弱表達。三種不同誘導條件下，MSCs誘導后的細胞不僅在形態(tài)上向神經樣細胞轉化，而且有神經元和神經膠質細胞標志物MAP<,2>、GFAP的表達，各組MAP<,2>和GFAP陽性細胞的比率隨培養(yǎng)時間的延長而增多；而Nestin陽性細胞比率誘導初期出現(xiàn)增高，但隨培養(yǎng)時間的延長而下降。神經培養(yǎng)液和生長因子誘導組，臍血MSCs向神經樣細胞轉化的過程

17、相對溫和，分化后細胞存活率高，其中以神經培養(yǎng)液+生長因子組細胞分化為神經樣細胞較早、產生MAP<,2>和GFAP陽性細胞比率較高(P<0.05)?；瘜W因子誘導組，雖誘導分化為神經元樣細胞效率較高，但誘導后細胞存活時間短，一般在3d后大部分細胞死亡。 3、人臍血MSCs體外培養(yǎng)移植治療新生大鼠HIBD的研究結果 腦內移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組大鼠腦組織內均可見大量DAPI標記陽性細胞，其中3-9％植入細胞表達MAP<

18、,2>或GFAP。DAPI標記陽性細胞均以腦損傷側海馬、紋狀體多見。損傷側腦組織部分血管內皮細胞處顯示DAPI標記陽性細胞。生后5w時腦內植入細胞較3w是明顯減少。而血液移植Ⅲ組大鼠腦內3w時僅有少量DAPI標記陽性細胞，5w時消失。Y型迷宮試驗，腦內移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組較假移植組學會次數(shù)均減少，記憶保存百分率明顯增高，提示腦內移植和早期血液移植臍血MSCS移植可明顯提高HIBD新生大鼠的學習和記憶能力；5w時血液移植Ⅰ組學

19、習記憶能力優(yōu)于其它組，提示早期(24h)血液移植的遠期療效最佳。腦內移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組均可減輕新生大鼠HZBD后海馬CA<,1>區(qū)神經細胞壞死，其中腦內移植和血液移植Ⅰ組移植效果較為顯著。結論 1．在適宜的體外培養(yǎng)條件下，可從健康產婦足月胎兒臍血中成功地培養(yǎng)出 MSCs，但臍血MSCs數(shù)量少、建立時間較長和頻率低是其主要特點。臍血 MSCs的免疫表型符合間充質干細胞特征。 2．臍血MSCs在體外特定的誘導

20、培養(yǎng)和微環(huán)境條件下，能向神經干細胞方向分化，并能分化為神經元和神經膠質細胞。生長因子和神經條件培養(yǎng)基可高效誘導MSCs轉化為神經元和神經膠質細胞。 3．HIBD新生大鼠早期血液移植和腦內海馬部位移植人臍血MSCs，植入的臍血MSCs可在腦內存活、遷移，與腦組織良好整合，并分化為神經元和神經膠質細胞，對缺失的神經細胞具有修復替代作用。 4．臍血MSCs移植可有效減輕HIBD大鼠海馬CA1區(qū)的細胞損傷，并有效改善HIBD新生