bmi-1小發(fā)夾RNA真核表達載體的構建及對LoVo細胞的影響.pdf

1、研究背景與目的：原癌基因bmi-1（bmi-1）是PcG（PcG）家族成員之一，它直接參與細胞生長、增殖的調節(jié)。研究證實人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程均與bmi-1基因表達異常有關，且與多種腫瘤的預后相關。RNA干擾技術是當前研究熱點，特定基因的小干擾RNA能在不影響細胞正?；蚬δ艿那疤嵯?，沉默腫瘤相關基因從而起到基因治療的作用。RNAi技術的應用領域已經(jīng)從基因組學研究逐步擴展到醫(yī)學領域并作為基因治療手段。利用RNAi不僅能提供一種經(jīng)濟

2、、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新思路。 本實驗構建針對bmi-1基因的shRNA表達載體，首先采取脂質體介導轉染法將帶有熒光標記的pEGFP-N1轉染大腸癌細胞初步判斷轉染效率及最適轉染細胞；再將構建好的shRNA表達載體經(jīng)脂質體介導轉染LoVo細胞系，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉染LoVo細胞系，經(jīng)熒光定量RT-PCR、Western Blot觀察shRNA表達載體是否抑制l

3、ovo細胞bmi-1 mRNA與蛋白表達，經(jīng)MTT與凋亡染色觀察shRNA表達載體對癌細胞生長、凋亡的影響。本實驗旨在bmi-1高表達的腫瘤中，探索能特異性封閉bmi-1的表達，將可能為腫瘤的基因治療提供新靶點，進一步為臨床腫瘤基因治療提供理論依據(jù)。 方法： 1．RT-PCR檢測bmi-1基因在大腸癌組織與癌旁對照組織中的表達，凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描分析bmi-1基因在大腸癌組織與癌旁對照組織中的表達情況。 2．根

4、據(jù)siRNA設計原則，設計靶向bmi-1小干擾RNA互補寡核苷酸鏈及無義對照序列。 3．將重組載體pSIREN-VEGF-C用內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，電泳鑒定后行膠回收獲得線性化pSIREN-RetroQ載體。 4．將單鏈退火形成互補雙鏈后與線性載體連接，構建重組逆轉錄病毒載體pSIREN-bmi-1-2及無義對照序列構建成的pSIREN-bmi-1．C；挑取LB平板上的陽性單克隆，雙酶切鑒定正確后送生物

5、公司測序。 5．大腸癌細胞按照常規(guī)貼壁腫瘤細胞培養(yǎng)，并梯度篩選出最佳嘌呤霉素濃度用于篩選穩(wěn)定轉染細胞。 6．用脂質體介導轉染法將帶有熒光標記的pEGFP-N1空質粒轉染四種不同大腸癌細胞，初步判斷轉染效率及最適轉染細胞。 7．采用脂質體介導轉染法，將逆轉錄病毒載體pSIREN-bmi-1-1（實驗室保存）、pSIREN-bmi-1-2及無義對照載體pSIREN-bmi-1-C分別轉染大腸癌細胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定

6、轉染的單克隆細胞，擴增培養(yǎng)。 8．熒光定量RT-PCR檢測轉染載體前后bmi-1基因在mRNA水平的表達情況。 9．Western Blot法檢測載體轉染前后細胞bmi-1蛋白表達的變化。 10．用MTT比色法檢測pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白對照組間增殖能力，并從形態(tài)學上觀察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-

7、bmi-1-C及空白對照組間的差異。 11．用AnnexinⅤ與PI雙染法染色觀察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白對照組間凋亡情況。 結果： 1．RT-PCR的表達研究顯示bmi-1 mRNA在癌組織中的表達高于相應癌旁組織，平均表達率為0．76±0．23、0．35±0．19。 2．利用分子克隆技術構建了重組逆轉錄病毒載體pSIREN-bmi-

8、1-2及psIREN-bmi-1-C，重組載體經(jīng)酶切電泳和測序鑒定，證實插入片段的大小、方向均與設計的一致。 3．在四種不同大腸癌細胞株中，經(jīng)脂質體介導轉染法將帶有熒光標記的pEGFP-N1空質粒轉染大腸癌細胞LoVo可獲得較高的轉染效率，其轉染效率約為50％。 4．嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染的單克隆大腸癌細胞的最佳劑量為5ug/ml。 5．熒光定量RT-PCR檢測bmi-1 mRNA水平的表達情況，結果顯示：pSIR

9、EN-bmi-1-2組bmi-1 mRNA水平與pSIREN-bmi-1-C及空白對照組相比，表達水平顯著降低，bmi-1 mRNA表達抑制率為80％，差異有統(tǒng)計學意義，而pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C與空白對照組之間兩兩相比，bmi-1 mRNA表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義。 6．Western Blot檢測bmi-1蛋白水平的表達研究顯示：bmi-1在pSIREN-bmi-1-2組的蛋白表達低于其它

10、三組的表達，bmi-1蛋白表達受抑制，抑制率為82％；但在pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C、空白對照組的蛋白表達無明顯差異，可見重組質粒pSIREN-bmi-1-2能夠抑bmi-1在蛋白水平的表達，而重組質粒pSIREN-bmi-1-1不具有此作用。 7．細胞生長曲線顯示：MTT比色法結果表明pSIREN-bmi-1-2組細胞與其它三組細胞比較生長緩慢，而pSIREN-bmi-1-1組、pSIREN-b

11、mi-1-C組對細胞生長沒有影響。 8．形態(tài)學檢測各重組載體與空白對照組在細胞形態(tài)學上無明顯差異。 9．細胞凋亡分析顯示各重組載體與空白對照組比較，不引起細胞凋亡。 結論： 1．半定量RT-PCR顯示bmi-1基因在大腸癌組織的表達高于癌旁組織。 2．重組載體pSIREN-VEGF-C經(jīng)雙酶切電泳鑒定后行膠回收獲得了線性化載體pSIREN-RetroQ，并成功構建了重組逆轉錄病毒載體pSIREN-

12、bmi-1-2及pSIREN-bmi-1-C。 3．在四種大腸癌細胞株中，采用脂質體介導轉染法易于將外源質粒轉入的是LoVo細胞。 4．pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2中，重組載體pSIREN-bmi-1-2抑制了bmi-1基因在LoVo細胞中mRNA、蛋白水平的表達，并能夠抑制LoVo細胞的增殖，但未引起明顯細胞形態(tài)改變，亦不能引起明顯的細胞凋亡；而重組載體pSIREN-bmi-1-1不能抑制