豬鏈球菌2型強毒株特有基因mmuM缺失株構建及特性分析.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis, SS）是世界范圍內(nèi)存在的一種重要的人畜共患病原體。它可分為33個血清型(1/2，1-31，33)，目前針對血清2型（Streptococcus suis2，S.suis2，SS2）的研究最為深入。無論是在中國國內(nèi)、東南亞地區(qū)還是世界范圍內(nèi)，關于SS2的研究報道最多，因為其致病性最強，感染案例最多。它可以引起豬的嚴重疾病，例如敗血癥，腦膜炎，關節(jié)炎和肺炎等，造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)

2、濟損失。在導致人類的疾病當中，腦膜炎是其最常見的表現(xiàn)型，此外它還可以引發(fā)其他全身并發(fā)癥如敗血癥，肺炎等。在我國曾經(jīng)爆發(fā)過兩次嚴重的豬鏈球菌感染人事件，并造成重大的人員傷亡。正是在這兩次爆發(fā)中，第一次觀察到由豬鏈球菌引起的中毒性休克綜合癥(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。同時，豬鏈球菌病在這兩次爆發(fā)中也體現(xiàn)出了深部組織感染和高侵襲率的臨床特征。與病毒不同，細菌基因組較大，基因組結(jié)構較為復雜

3、且構成菌體的蛋白數(shù)量很多，所以為其致病機理的研究帶來了很多困難。雖然目前關于引起和促進其發(fā)病的毒力因子的研究較多，但對于豬鏈球菌的致病機理仍舊沒有完全明確。所以，研究探索其致病菌株的毒力因子仍是當今豬鏈球菌的研究熱點。
　　本研究同樣是圍繞著探尋和驗證豬鏈球菌的毒力因子而展開的。主要包括以下幾個方面:
　　1、豬鏈球菌2型強毒株特有基因mmuM的鑒定
　　在之前的研究中通過內(nèi)標化的斑馬魚模型對若干豬鏈球菌強弱毒株進行篩

4、選。選取篩選到的7株弱毒株進行全基因組測序，并與NCBI上已經(jīng)公布的10株強毒株全基因組進行泛基因組(pan-genome)分析。通過pan-genome分析，發(fā)現(xiàn)了53個在SS2強毒株中存在但是弱毒株中沒有的基因，推測這些SS2強毒株共同特有的基因是潛在的毒力因子。mmuM基因就是這53個基因之一，編碼同半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocystine methyltransferase，HMT)。對之前用斑馬魚模型篩選到的一些豬鏈球菌2型

5、強弱毒株以及豬鏈球菌其他血清型菌株進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)mmuM基因只存在于豬鏈球菌2型強毒株中。因此，我們推測mmuM基因與豬鏈球菌2型的致病性相關，是可能的毒力因子。
　　2、mmuM、 OppA和IMPDH的原核表達及重組蛋白對HEp-2細胞的黏附性分析
　　對豬鏈球菌2型強毒株特有基因mmuM進行了原核表達，同時對我們用2D far-western blot方法篩選出的15個層粘蛋白(laminin，LN)結(jié)合蛋白和5

6、個纖粘蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)結(jié)合蛋白中的兩個蛋白OppA(Oligopeptide-binding protein OppAprecursor，對LN和FN均有結(jié)合性，LN結(jié)合性為第一次發(fā)現(xiàn)）和IMPDH（Inosine5'-monophosphate dehydrogenase，有LN結(jié)合性，第一次發(fā)現(xiàn)有此特性）進行了原核表達，并對它們的ECM結(jié)合性進行了驗證。間接免疫熒光試驗結(jié)果表明，以上三種原核表達得到的重組蛋白均對

7、人喉癌上皮細胞（HEp-2）有粘附性。這一結(jié)果也證明了用2D far-western blot篩選ECM結(jié)合蛋白從而確定潛在粘附因子這一思路和方法的可行性。
　　3、mmuM基因缺失株和互補株的構建及它們的特性分析
　　為了驗證mmuM是潛在毒力因子的推測，我們以豬鏈球菌2型強毒株ZY05719為研究對象，采用經(jīng)典的同源重組方法，利用溫敏自殺性質(zhì)粒pSET4s成功構建了mmuM基因的缺失株ΔmmuM，然后利用穿梭質(zhì)粒pSET

8、2成功構建了互補株CΔmmuM?；镜纳飳W特性研究發(fā)現(xiàn)ZY05719、ΔmmuM和CΔmmuM三者的生長特性、溶血特性、革蘭氏染色特性及電鏡下的菌體形態(tài)相近。通過對本室保存的其他血清型的豬鏈球菌進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其他血清型中并不合有mmuM基因，這就進一步提示mmuM基因只存在于豬鏈球菌2型強毒株中;通過斑馬魚毒力試驗發(fā)現(xiàn)，相對于野生株ZY05719，缺失株的毒力水平有所下降;細胞粘附試驗發(fā)現(xiàn)，ΔmmuM缺失株對人喉癌上皮細胞（HE

9、p-2）的粘附能力顯著下降;全血存活試驗(Whole blood survival assay)表明缺失株在豬抗凝全血中的存活率相對于野生株有較為明顯的下降;實時熒光定量PCR顯示已報道的公認毒力因子sly2C、mrp和sly在缺失株ΔmmuM中的轉(zhuǎn)錄水平均有所下降。我們推測，mmuM基因可能也是豬鏈球菌2型的一個毒力因子。
　　4、ΔmmuM和ZY05719的差異蛋白質(zhì)組學分析
　　Label-free蛋白質(zhì)組學對野生株Z

10、Y05719、缺失株ΔmmuM全菌蛋白表達水平進行分析。發(fā)現(xiàn)了91個在缺失株中比在野生株中表達水平下調(diào)1.5倍的蛋白，66個在缺失株中表達水平比在野生株中表達水平上調(diào)1.5倍的蛋白，而且這些蛋白的表達水平差異顯著(P＜0.05)。在缺失株中表達下調(diào)的蛋白中，發(fā)現(xiàn)幾個下調(diào)明顯的且已報道與細菌對細胞的粘附性或者毒力相關的蛋白，包括3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAP