突變型Myocilin調(diào)控人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的實驗研究.pdf

1、1997年StoneEM等于《science》雜志上首次報道Myocilin基因為原發(fā)性開角型青光眼的致病基因，自此掀起開角型青光眼發(fā)病機制的新的研究熱潮。然而，到目前為止，Myocilin基因突變是否是家族性開角型青光眼的確切致病基因仍眾說紛紜，存有爭議。 1985年，葛堅教授在我國首次確立家族性開角型青光眼大家系—廣州1號(GZ.1)。此后，其所帶領(lǐng)的課題組對該家系進行了長達20年的追蹤調(diào)查，并展開一系列全面、系統(tǒng)的臨床及實

2、驗室研究，確定Myocilin基因P370L突變是GZ.1家族性開角型青光眼的致病基因，該家系患者中P370L突變頻率為100％；進而，GZ.1家系密切相關(guān)的P370L突變型Myocilin蛋白功能的初步研究顯示P370L突變型Myocilin蛋白細胞外分泌障礙，在胞漿內(nèi)形成積聚體(aggresomes)引起人小梁細胞收縮、粘附、遷移功能的改變。然而，P370L突變型Myocilin究竟通過何種病理途徑損傷人小梁細胞結(jié)構(gòu)和功能，進而導(dǎo)致

3、GZ.1家族性開角型青光眼的發(fā)病尚不清楚。 本研究為闡明P370L突變型Myocilin的人小梁細胞損害機制，通過構(gòu)建P370L突變型Myocilin基因真核表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染人小梁細胞，建立P370L突變型Myocilin體外功能研究模型，經(jīng)系統(tǒng)分子生物學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin調(diào)控人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，擾亂其蛋白質(zhì)合成及分泌功能，同時損傷線粒體結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致人小梁細胞形態(tài)異常，細胞粘附性下降，細胞死

4、亡。另外，我們還發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin上調(diào)人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路—糖蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解反應(yīng)，在早期損傷同時激發(fā)細胞保護性反應(yīng)。 據(jù)此，我們證實P370L突變型Myocilin蛋白因蛋白錯誤折疊，構(gòu)象改變而獲得病理性功能，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能引發(fā)人小梁細胞級聯(lián)病理反應(yīng)。本研究初步揭示P370L突變型Myocilin的人小梁細胞損傷機制，為其完全釋解提供確實的實驗依據(jù)，同時為GZ.1家族性開角型青光眼發(fā)病

5、機制的研究以及有效防治措施的發(fā)展提供新思路。 目的：通過在體外人小梁細胞中特定表達P370L突變型Myocilin蛋白，檢測其因錯誤折疊，構(gòu)象改變對人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能的調(diào)控作用，探討P370L突變型Myocilin對小梁細胞的損傷機制，為釋解P370L突變型Myocilin的致病機制提供實驗依據(jù)，同時為GZ.1開角型青光眼家系發(fā)病機制的研究以及有效防治措施的發(fā)展提供新思路。 方法 1.應(yīng)用定點誘變技術(shù)構(gòu)

6、建P370L突變型MYOC真核表達載體，通過陽離子脂質(zhì)體將pcDNA3.1載體，pcDNA-wild-type-MYOC載體及pcDNA-MYOC-P370L載體體外瞬時轉(zhuǎn)染人小梁細胞； 2.應(yīng)用RT-PCR檢測人小梁細胞Myocilin、GRP78、ATF4、ATF6及XBP1mRNA的表達； 3.應(yīng)用Westernblot檢測人小梁細胞Myocilin蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78蛋白、XBP1蛋白、Phospho-

7、eIF2alpha蛋白的表達； 4.應(yīng)用細胞免疫化學(xué)染色法通過共聚焦顯微鏡觀察GRP78蛋白與Myocilin蛋白的共定位情況以及Paxillin的表達； 5.應(yīng)用MTT法檢測人小梁細胞代謝率； 6.應(yīng)用JC-1染色法通過流式細胞儀及共聚焦顯微鏡檢測人小梁細胞線粒體膜電位； 7.應(yīng)用AnnexinV/PI染色法通過流式細胞儀檢測人小梁細胞磷脂酰絲氨酸外翻； 8.應(yīng)用倒置相差顯微鏡和透射電鏡進行人小

8、梁細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的觀察。 結(jié)果 1.酶切及測序鑒定確定pcDNA-MYOC-P370L真核表達載體閱讀框及突變位點正確。 2.RT-PCR及Westernblot檢測結(jié)果顯示pcDNA-wild-type-MYOC載體及pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染后人小梁細胞MyocilinmRNA及Myocilin蛋白表達顯著增加。 3.RT-PCR及Westernblot檢測結(jié)果分別顯示pcDNA-M

9、YOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組相比人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78mRNA、GRP78蛋白質(zhì)及Phospho-eIF2α蛋白表達顯著減少，XBP1mRNA及XBP1蛋白質(zhì)表達顯著增多；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。 4.pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組人小梁細胞MTT代謝率為(72.6±3.8)％明顯低于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(92.5±4.2)％，

10、兩組相比MTT代謝率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯改變。 5.pcDNA-MYOC-P370L載體瞬時轉(zhuǎn)染人小梁細胞熒光探針JC-1的紅色/綠色熒光強度比值(1.4±0.3)顯著低于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(3.2±0.4)(P＜0.01)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。共聚焦顯微鏡觀察顯示各組均無細胞色素C的釋放。 6

11、.共聚焦顯微鏡觀察顯示pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組人小梁細胞Paxillin蛋白質(zhì)的表達量與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染細胞相比明顯減少；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組其表達無明顯改變。 7.AnnexinV/PI雙標(biāo)法結(jié)果顯示pcDNA-MYOC-P370L瞬時轉(zhuǎn)染后，人小梁細胞FITC-AnnexinV(+)/PI(-)細胞占總細胞的百分率為(47.09±4.16)％，與pcDNA3.1空載

12、體轉(zhuǎn)染組相比明顯增高(12.38±1.18)％(P＜0.01)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。 8.相差顯微鏡下pcDNA-MYOC-P370L載體瞬時轉(zhuǎn)染組人小梁細胞形態(tài)異常，空泡變，并有大量細胞死去。透射電鏡觀察到人小梁細胞細胞膜不完整、線粒體嵴斷裂、線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張以及脂滴和空泡增多；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組人小梁細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。

13、 結(jié)論 1.P370L突變型Myocilin蛋白因錯誤折疊、構(gòu)象改變而獲得病理性調(diào)控功能，擾亂人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，改變其合成和分泌功能。 2.P370L突變型Myocilin蛋白在損傷人小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的同時引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和氧化磷酸化功能的損傷，嚴(yán)重影響細胞生物活性，表明P370L是一種強致病性突變位點。 3.P370L突變型Myocilin真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染人小梁細胞產(chǎn)生細胞毒性，引發(fā)相應(yīng)