動物冠狀病毒的檢測及應用研究.pdf

1、冠狀病毒獨特的先導引物轉錄機制，導致了冠狀病毒抗原變異株層出不窮以及具有很高的重組率，這都給動物冠狀病毒的檢測與防制帶來了很大的困難。因此，建立有效的動物冠狀病毒檢測方法，對有效控制動物冠狀病毒的流行非常重要。 參考GenBank中公布的冠狀病毒相關序列，根據(jù)動物冠狀病毒聚合酶基因的保守區(qū)段設計一對通用引物，建立一種動物冠狀病毒通用PCR方法。用這種方法可以檢測是否為冠狀病毒感染，而且不同群的冠狀病毒都可以用這一對引物進行簡潔、

2、快速地診斷。特異性試驗表明將CCV、FCV等冠狀病毒用通用PCR方法均擴增出449bp目的條帶，而陰性對照沒有。敏感性試驗表明，其敏感程度同于常規(guī)PCR方法。通過克隆測序將不同病毒的聚合酶基因與相應病毒的不同毒株BLAST，同源性為96﹪～99﹪，表明通用引物用于擴增冠狀病毒的正確性。將擴增的聚合酶基因與冠狀病毒的參考毒株進行同源性比對結果在56.69﹪～99.55﹪之間。進化樹分析FCV、TGEV、FIPV、CCV、PRCV、HCV-

3、229E為一個抗原群，BCV、HCV-Paris、MHV-A59為另一個抗原群，SARS為新的一個抗原群。這個結果與文獻中對冠狀病毒根據(jù)血清學與基因學角度分類報道的一致。 在基因芯片研制成功的基礎上，對不同動物冠狀病毒進行動物回歸試驗，將攻毒的組織樣品利用多重PCR擴增以Cy3為標記物與基因芯片上多個基因克隆進行雜交，同時將基因芯片檢測的結果與RT-PCR、病原組織分離鑒定的結果進行比較，實驗結果表明，對于RT-PCR和病原組織

4、分離鑒定為陰性的樣品基因芯片檢測呈陽性，而且可以得出RT-PCR檢測比病原組織分離鑒定更靈敏。因此，從基因芯片應用的角度用實驗證實基因芯片技術檢測動物冠狀病毒比其他的方法更靈敏、更準確。 根據(jù)NCBI中公布犬冠狀病毒Tn449株的基因序列，通過RT-PCR擴增出S基因890bp的片段，克隆測序并與參考毒株進行同源性比較和進化樹分析，結果表明CCVTn449株與CCV的UCD-1株和Emlo/02株同源性最低，尤其是Emlo/02