蘋果屬觀賞海棠類黃酮種類、代謝及生物活性分析.pdf

1、觀賞海棠屬于蘋果屬植物家族中的一員，由于其葉色色彩豐富，花色有紅白粉，且花期時(shí)間較長，果實(shí)小且色彩明亮，宿存期長，所以觀賞海棠在我國作為一種觀賞性植物廣泛的種植。但是除了具有較高的觀賞價(jià)值之外，其植物體內(nèi)富含多種的天然生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)的開發(fā)和提取對(duì)醫(yī)藥、日化、食品等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義，也是我國農(nóng)業(yè)研究的一個(gè)重點(diǎn)方向，越來越受到人們的重視。其中二氫查爾酮類化合物在自然界中存在很少，作為‘少數(shù)黃酮類’化合物具有潛在的研究價(jià)

2、值；其中已有研究報(bào)道二氫查爾酮根皮苷在蘋果植物中含量豐富，由于其甜味高，熱量低的優(yōu)良特性，同時(shí)還具有美白的功效，其作為一種食品甜味劑和美白成分用于添加到食品和化妝品的制造業(yè)中。觀賞海棠作為蘋果屬植物中的野生資源，其類黃酮的類型和含量更為豐富，比栽培種蘋果植物更具有較大的研究與開發(fā)利用價(jià)值，但有關(guān)此類植物中類黃酮物質(zhì)的研究報(bào)道較少，尤其是二氫查爾酮類化合物的研究，開發(fā)以及利用基本處于空白；因此，全面的研究類黃酮物質(zhì)在植物體內(nèi)的種類與分布，

3、探究類黃酮物質(zhì)的生活活性，通過篩選，重點(diǎn)選育出二氫查爾酮類化合物含量高的植物品種，利用分子生物學(xué)方法，研究二氫查爾酮類化合物代謝合成途徑中的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子，最后利用基因工程、代謝工程技術(shù)合成二氫查爾酮類物質(zhì)，是進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生成的必由之路，具有積極的學(xué)術(shù)價(jià)值和可以預(yù)見的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。
　　本研究以新葉有色類典型品種‘絢麗’為主要試驗(yàn)材料，以常色紫紅葉類典型品種‘王族’和綠葉類典型品種‘火焰’為對(duì)比材料，首先通過高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)

4、用（HPLC-MS）以及超高液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)檢測(cè)了根，葉，花瓣，果皮和果肉中類黃酮物質(zhì)的類型，采用高效液相色譜法（HPLC）分析了葉片，花瓣和果實(shí)中每一個(gè)類黃酮物質(zhì)在不同發(fā)育時(shí)期中的含量變化，重點(diǎn)分析了二氫查爾酮化合物的種類以及分布部位；其次，通過多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段，主要包括多樣性分析，主成分分析以及聚類分析等分析方法優(yōu)選出具有最佳時(shí)空格局的發(fā)育時(shí)期，同時(shí)篩選出優(yōu)勢(shì)植物材料；第三，通過體內(nèi)動(dòng)物模型和體外試

5、驗(yàn)，結(jié)果表明在觀賞海棠類黃酮系統(tǒng)中不同化合物之間通過協(xié)同互作的方式，產(chǎn)生了協(xié)同抗氧化的功能；第四，本研究系統(tǒng)分離純化出觀賞海棠中的主要類黃酮組分，并通過核磁共振技術(shù)驗(yàn)證出兩種新的二氫查爾酮化合物；第五，本研究分離純化出來的二氫查爾酮單體，通過 MTT法[MTT,四氮唑,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]，驗(yàn)證了它們的抗腫瘤活性；最后，通過分子生物學(xué)

6、手段，探討調(diào)控二氫查爾酮類化合物代謝途徑中的關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子與主要結(jié)構(gòu)基因。
　　本研究中的主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.通過HPLC-MSn和UPLC-Qtof-MSn技術(shù)檢測(cè)，觀賞海棠中含有類黃酮類型最多的是葉片，‘王族’有17種，‘絢麗’有21種，‘火焰’有15種；其次是花，‘王族’有17種，‘絢麗’有17種，‘火焰’有17種；再次是果皮和果肉，‘王族’果皮有15種，果肉有9種，‘絢麗’果皮有15種，果肉有10種；‘火

7、焰’果皮有11種，果肉有9種，根的最少，三個(gè)品種均為2種。這些主要的類黃酮化合物包括花色苷，黃酮醇，二氫查爾酮、黃烷醇和二氫黃酮醇，其中在觀賞海棠中，二氫查爾酮類化合物主要有13種，且絢麗品種中的二氫查爾酮化合物類型豐富；通過HPLC方法，類黃酮物質(zhì)含量最豐富的部位是葉片，其次是花瓣，果皮和果肉；二氫查爾酮根皮苷含量最多的部位是根；果肉中類黃酮物質(zhì)的含量最少；此外，通過多樣性分析，主成分分析以及聚類分析，本研究建立一種分析手段，此方法也

8、可以運(yùn)用到對(duì)其它植物中復(fù)雜的類黃酮系統(tǒng)的分析研究中。
　　2.通過體內(nèi)動(dòng)物模型和體外兩種試驗(yàn)結(jié)果表明，觀賞海棠紅色葉片‘王族’具有很強(qiáng)的抗氧化能力，這種植物資源可以作為一種新的食品添加劑加以開發(fā)利用；通過改進(jìn)HPLC-ABTS在線測(cè)定抗氧化系統(tǒng)，從總的抗氧化能力大于單個(gè)化合物的抗氧化總和，研究表明在植物體內(nèi)的類黃酮系統(tǒng)中存在一種協(xié)同抗氧化功能；通過分析動(dòng)物模型中總抗氧化能力與血糖、膽固醇和甘油三酯的線性回歸方程，表明攝取一定的抗氧

9、化劑，動(dòng)物體內(nèi)可以增強(qiáng)抵抗力，防御疾病保護(hù)身體機(jī)能。
　　3.利用分離純化系統(tǒng)以及核磁共振技術(shù)，本研究系統(tǒng)分離了海棠葉片中的類黃酮化合物，共得到了20個(gè)化合物。其中黃酮醇類化合物8個(gè)：HTY-1(胡桃寧,418.35)，HTY-2(扁蓄苷)，HTY-3(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)，HTY-5(槲皮素-3-O-鼠李糖苷)，HTY-8(槲皮素-3-O-木糖苷)，HTY-9(槲皮素-4’-O-葡萄糖苷)，HTY-10(蘆丁)，HTY-3

10、0-1(槲皮素)。二氫黃酮醇類化合物2個(gè)：HTY-14(落新婦苷)，HTYZB-4(花旗松素-3-O-葡萄糖苷)。二氫查耳酮類化合物7個(gè)：HTY-4(三葉苷)，HTY-12(根皮苷)，HTY-30-2(根皮素)。HTY-30-5(3-羥基根皮素)，HTYZB-1-3(6′′-O-香豆?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷A)，HTYZB-1-4(3′′′-甲氧基-6′′-O-阿魏?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷B)，HTGL-

11、4(根皮素蕓香糖苷)。黃烷醇類化合物1個(gè)：HTY-11(表兒茶素)。酚酸類化合物1個(gè)：HTY-15(隱綠原酸)。二氫黃酮類化合物1個(gè)：HTY-30-3(圣草酚)。其中HTYZB-1-3(6′′-O-香豆?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷 A)，HTYZB-1-4(3′′′-甲氧基-6′′-O-咖啡?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷B)為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物。
　　4.通過測(cè)定人體癌細(xì)胞試驗(yàn)，本研究提取分離純化出來的7個(gè)二

12、氫查爾酮單體化合物表現(xiàn)出顯著的生物活性。尤其單體化合物根皮素(A2)，3-羥基根皮素(A3)，6′′-O-香豆?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷A(A6)和甲氧基-6′′-O-阿魏?；?4′-O-葡萄糖基-根皮素，海棠苷B(A7)對(duì)腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549，Bel7402，HepG2和HT-29有著較強(qiáng)的抑制活性，其中海棠苷B化學(xué)結(jié)構(gòu)式中含有一個(gè)甲氧基基團(tuán)，活性更為明顯。這表明二氫查爾酮這類化合物可能對(duì)人體健康有著重要的影響，可以考慮作

13、為一種潛在的治療癌癥的藥物發(fā)展利用。同時(shí)，結(jié)果表明，觀賞海棠是一種天然的具有顯著抗腫瘤效果的可利用自然資源，此外，本研究分離出的兩個(gè)新稀有化合物A6和A7可發(fā)展成一種新型的具有研究價(jià)值的抗腫瘤活性藥物。
　　5.利用VIGS以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行MYB10沉默試驗(yàn)，二氫查爾酮化合物的含量以及相關(guān)基因表達(dá)量下降，說明MYB10轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控觀賞海棠葉片和果皮中二氫查爾酮的合成；沉默MYB16轉(zhuǎn)錄因子對(duì)二氫查爾酮化合物有上調(diào)

14、的作用；乙?；ㄟ^下調(diào)ENRL基因來調(diào)控NADPH的合成，進(jìn)而抑制二氫查爾酮根皮苷的合成，去乙酰化通過上調(diào)NADPH促進(jìn)二氫查爾酮根皮苷的合成；本研究結(jié)果表明，觀賞海棠中調(diào)控二氫查爾酮根皮苷合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶是NADPH，McCHS在一定程度上可以促進(jìn)根皮苷的合成，但不是起著決定作用；McENRL基因的上調(diào)對(duì)根皮苷的合成起著直接作用。
　　綜合以上研究結(jié)果，觀賞海棠中含有大量的抗氧化物質(zhì)，其中二氫查爾酮化合物是一類具有抗腫瘤活