PTEN和GLP-1類似物利拉魯肽在游離脂肪酸誘導β細胞損傷中作用的研究.pdf

1、肥胖是2型糖尿病(T2DM)發(fā)生和發(fā)展最主要的危險因素，其顯著特征是患者體內游離脂肪酸（Freefattyacid，FFA）持續(xù)升高。越來越多的證據表明，血漿FFA濃度的升高不僅可以增加周圍組織的胰島素抵抗，還可以損害β細胞功能，抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌和β細胞增殖，誘導β細胞凋亡，降低β細胞數量，最終導致糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。因此，減少FFA對β細胞損傷可能是一種新的2型糖尿病治療策略。
　　PTEN是一個具有磷酸酶活性的抑癌基

2、因，其突變缺失可導致很多腫瘤的發(fā)生。近來研究發(fā)現，PTEN除在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用外，在糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中也起到一定的作用。Akt是PTEN主要的下游基因，還受到PI3K的調節(jié)，而胰島素受體底物（IR2/PI3K）通路在β細胞功能和數量的調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。因此，PTEN可以通過拮抗PI3K通路影響β細胞功能。另外，PTEN的磷酸酶活性可以將PIP3去磷酸化為PIP2。PIP2是一個重要的內源性的ATP敏感性鉀離子通道調節(jié)因子。

3、因此PTEN可能通過PIP2間接調節(jié)KATP通道，影響胰島素分泌。
　　利拉魯肽是一種經過修飾的GLP-1類似物。GLP-1對β細胞有一定的保護作用，它不僅可以提高葡萄糖刺激的胰島素分泌，改善β細胞功能，而且還可以促進β細胞增殖，抑制β細胞凋亡。研究表明，GLP-1的這些功能是可以通過對KATP通道和Akt通路的調節(jié)來實現的。因此利拉魯肽有可能通過對KATP通道和Akt通路的調節(jié)來改善PTEN介導的游離脂肪酸對β細胞的損傷。

4、>　　為了探討PTEN和利拉魯肽在游離脂肪酸誘導β細胞損傷中的作用，本研究進行了如下實驗：
　　實驗一、PTEN在游離脂肪酸誘導β細胞凋亡中的作用
　　目的：探討PTEN在游離脂肪酸誘導的β細胞凋亡中是否發(fā)揮作用。方法：應用棕櫚酸處理βTC-3細胞，構建FFA誘導β細胞凋亡模型，應用siRNA敲除PTEN。分別應用MTT比色實驗，流式法檢測細胞活力和細胞凋亡情況。采用RealtimePCR和Westernblot法檢測PTE

5、NmRNA和蛋白水平的變化。應用Westernblot法檢測p-Akt，Akt和Active-Caspase3的改變。結果：MTT和流式結果顯示棕櫚酸可以降低β細胞活力，誘導β細胞凋亡。Westernblot結果顯示經棕櫚酸處理24h后β細胞p-PTEN和p-Akt蛋白表達下降，Active-Caspase3蛋白表達增加。RealtimePCR檢測結果顯示棕櫚酸處理后β細胞PTENmRNA增加。β細胞經PTENsiRNA轉染后，棕櫚酸誘

6、導的β細胞凋亡減少，p-Akt蛋白表達增加，Active-Caspase3蛋白表達減少。結論：棕櫚酸可以促進PTEN轉錄，增加PTEN活性，從而抑制Akt激活促進β細胞凋亡。PTEN參與了棕櫚酸誘導的β細胞凋亡。
　　實驗二、PTEN對β細胞ATP敏感性鉀離子通道的影響
　　目的：探討游離脂肪酸對β細胞ATP敏感性鉀離子通道影響及PTEN在此過程中的作用。方法：βTC-3細胞經棕櫚酸處理24h后應用放免法檢測2.8mM和22

7、.4mM葡萄糖刺激的胰島素分泌。再分別應用Dotblot和RealtimePCR檢測KATP通道活性相關基因PIP2和KATP通道亞基Kir6.2和SUR1mRNA的表達。βTC-3細胞分別經ControlsiRNA和PTENsiRNA轉染后，再用1mM棕櫚酸處理24h，應用RealtimePCR檢測Kir6.2和SUR1mRNA的表達。結果：細胞經棕櫚酸處理后葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）,Kir6.2和SUR1的mRNA下降，P

8、IP2增加。經PTENsiRNA轉染細胞的Kir6.2和SUR1mRNA表達高于經ControlsiRNA轉染細胞。結論：PTEN通過調節(jié)PIP2和KATP通道亞基Kir6.2和SUR1參與FFA對β細胞ATP敏感性鉀離子通道影響。
　　實驗三、利拉魯肽對游離脂肪酸介導的β細胞損傷的保護作用
　　目的：探討GLP-1類似物利拉魯肽對游離脂肪酸介導β細胞損傷的保護作用。方法：βTC-3細胞經利拉魯肽處理24h后，應用Realt

9、imePCR檢測Kir6.2mRNA。細胞單獨經利拉魯肽處理24h，或經利拉魯肽預處理1h之后加入棕櫚酸共孵育24h，用RealtimePCR檢測Kir6.2mRNA，應用Westernblot檢測p-Akt、Akt、Active-Caspase3的表達。結果：經利拉魯肽處理后Kir6.2mRNA和p-Akt表達增加，Active-Caspase3表達下降。利拉魯肽與棕櫚酸共孵育細胞組Kir6.2mRNA和p-Akt高于單獨棕櫚酸處理的