APEC及其PhoP-Q缺失株感染對雛雞腸道AvBD6表達的影響.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）被證明不僅能夠感染禽類，還可以感染哺乳動物（包括人），這表明禽致病性大腸桿菌是人獸共患病的潛在病原體。PhoP/Q是APEC中調控關鍵毒力因子的重要二元調控系統(tǒng)，其對APEC誘導機體內防御反應起重要作用。禽β-防御素（Avianβ-defensins，AvBDs）抗菌能力強、抗菌譜廣、作用機制獨特，已然成為生物醫(yī)學領域當前的研究熱點。禽β-防

2、御素6（AvBD6）在禽類先天宿主防御系統(tǒng)中起重要作用，其在消化道內表達量較高，且抗微生物活性較為廣泛。
　　目前，有關PhoP/Q二元調控系統(tǒng)與機體內防御素的相互作用，尚未見報道。因此，為了探討雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株過程中，腸道內AvBD6的表達與分布情況，本研究用APEC及其PhoP/Q缺失株感染14日齡的雛雞（羅曼雞），構建感染雛雞腸道模型，并觀察病理變化。菌液感染雛雞后，分別于不同時間點采取各段小腸組織，

3、利用FQ-PCR檢測AvBD6 mRNA在小腸組織的轉錄水平，免疫組化技術檢測AvBD6蛋白在小腸組織的分布規(guī)律。開展本實驗為研究AvBDs在抗APEC感染中的應用奠定基礎，同時也為揭示PhoP/Q二元調控系統(tǒng)對APEC感染雞后誘導AvBDs抗感染的調控作用機理提供理論依據。具體研究內容和結果如下：
　　1. APEC及其PhoP/Q缺失株感染雛雞腸道及其病理變化
　　經腿肌分別接種濃度為1×106 cfu/mL的 APEC

4、菌液和APEC PhoP/Q缺失株菌液0.5 mL（空白對照組用PBS代替），分別建立APEC感染雛雞和APEC PhoP/Q缺失株感染雛雞模型，并觀察病理變化。結果顯示雛雞在接種APEC及其PhoP/Q缺失株48 h時出現典型病變，即腸粘膜腫脹，甚至出現血管破裂出血，形成出血性腸炎。小腸絨毛上皮組織脫落，杯狀細胞被溶解，絨毛中心軸部位紅細胞和炎性細胞數量增加。
　　2.雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺失株后小腸組織AvBD6

5、mRNA的表達
　　14日齡的羅曼雞分別接種APEC和APEC PhoP/Q缺失株菌液，于感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h采集小腸組織（包括十二指腸、空腸和回腸），應用FQ-PCR方法檢測雛雞在感染過程中腸道內AvBD6 mRNA的轉錄水平。結果顯示雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺失株24-48 h，小腸各段AvBD6 mRNA表達量表現為：PhoP/Q缺失株攻毒組>APEC攻毒組>空白對照組；AvB

6、D6 mRNA表達量于48 h達到峰值且顯著高于其余各時間段（P<0.05）；空白對照組中雛雞十二指腸和空腸的 AvBD6 mRNA相對表達量最高，且在0-48 h內基本呈水平態(tài)勢；感染0-48 h時，APEC攻毒組雛雞空腸AvBD6 mRNA轉錄量相對較高；APEC PhoP/Q缺失株感染雛雞48 h內十二指腸AvBD6 mRNA轉錄量顯著高于空腸和回腸（P<0.01或P<0.05）。
　　3.雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺

7、失株后小腸組織AvBD6蛋白的表達
　　根據FQ-PCR的檢測結果，于感染48 h時采集各組十二指腸、空腸和回腸組織，運用免疫組化方法檢測雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株時AvBD6在腸道中的蛋白表達情況。結果顯示，AvBD6蛋白在各組小腸內均有不同程度的分布，在攻毒組雛雞小腸各段的絨毛上皮細胞和十二指腸中的類十二指腸腺、空腸及回腸的腸腺部分有不同程度的分布。AvBD6蛋白在小腸組織內的陽性信號呈棕黃色。利用Image-p

8、ro plus6.0軟件對各組織切片的平均光密度值進行檢測，用其代表AvBD6的蛋白相對表達量，結果顯示APEC攻毒組和PhoP/Q缺失株攻毒組同腸段AvBD6的蛋白相對表達量較空白對照組顯著升高（P<0.01或P<0.05）。
　　以上試驗結果表明，14日齡羅曼雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株后，AvBD6 mRNA在雞小腸各段的分布和表達具有一定規(guī)律性，在感染48 h內AvBD6 mRNA的表達水平在48 h時最高，且