重組人β防御素4的原核表達(dá)、純化及抗銅綠假單胞菌活性初探.pdf

1、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa，PA)，是一種常見的院內(nèi)獲得性感染條件致病菌，在自然界分布廣泛，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，它常常引起創(chuàng)傷及免疫受損機(jī)體的嚴(yán)重感染，也是燒傷患者極易發(fā)生感染的菌種之一，病死率較高，預(yù)防和治療銅綠假單胞菌感染已成為降低燒傷病人致殘率和病死率的主要措施。由于其能形成生物膜，以及對(duì)大多數(shù)的抗生素具有耐藥性使得其很難被徹底治療。特別是近期已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)亞胺培南和全部第三代頭孢菌素及常用抗假

2、單胞菌藥物均耐藥的多重耐藥銅綠假單胞菌。針對(duì)銅綠假單胞菌耐藥性日益增強(qiáng)，而抗生素療效愈來(lái)愈下降的迫切現(xiàn)狀，如何研發(fā)更有效的藥物治療銅綠假單胞菌感染，已成為抗感染治療急待解決的問(wèn)題。 人防御素是機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道天然防線，是人體內(nèi)重要的天然免疫物質(zhì)；人防御素含40～50個(gè)氨基酸，是分子質(zhì)量為4～5 kDa的陽(yáng)離子短肽，精氨酸含量相對(duì)豐富，為非糖基化蛋白。分子內(nèi)含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，可形成3個(gè)典型的分子內(nèi)二硫鍵，構(gòu)

3、成3個(gè)穩(wěn)定的反向p片層結(jié)構(gòu)；是一類具有廣譜抗微生物活性的小分子抗菌肽，具有抗菌、抗病毒及殺傷腫瘤細(xì)胞的多種效應(yīng)。人β防御素4(human Beta defensin4)是由Wolf-Georg Forssmann于2001年發(fā)現(xiàn)，屬于β防御素，含有50個(gè)氨基酸，具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)耐藥性銅綠假單胞菌具有強(qiáng)大的殺菌作用。Yanagi研究表明在所有銅綠假單胞菌感染的病人中都可檢測(cè)到HBD2和HBD4表達(dá)，體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明HBD2和

4、HBD4對(duì)銅綠假單胞菌有很強(qiáng)的殺傷活性，HBD4的殺傷活性更高，這些結(jié)果都表明在銅綠假單胞菌感染的過(guò)程中，HBD2和HBD4在機(jī)體的感染防御中發(fā)揮著重要作用：針對(duì)HBD4對(duì)銅綠假單胞菌高殺傷活性，臨床燒傷研究人員將HBD4基因?qū)肫つw細(xì)胞，使其能高表達(dá)HBD4以用來(lái)治療預(yù)防銅綠假單胞菌對(duì)燒傷皮膚的感染；結(jié)果表明，與普通皮膚細(xì)胞相比，該基因工程細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌有很強(qiáng)的抑制性。HBD4天然產(chǎn)量非常低，而化學(xué)合成成本相當(dāng)高，通過(guò)基因工程技術(shù)

5、生產(chǎn)防御素可滿足科研和開發(fā)新藥研究的需要，具有廣闊的應(yīng)用前景。 由于抗菌肽對(duì)宿主的毒性，在E.coli系統(tǒng)中直接表達(dá)抗菌肽產(chǎn)量很低，且易受到宿主細(xì)胞蛋白酶的降解。融合表達(dá)或在酵母中表達(dá)是兩種解決方法，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，已有好多陽(yáng)離子肽在大腸桿菌中成功融合表達(dá)。鑒于以上的問(wèn)題，我們選用了目前表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的pET系統(tǒng)，并在目的蛋白N端融合谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白標(biāo)簽，在大腸桿菌中

6、表達(dá)可溶性重組GST融合人β防御素4蛋白。為了獲得天然N端的β人防御素4蛋白，我們?cè)贕ST標(biāo)簽與人β防御素4蛋白之間添加了腸激酶(Enterokinase)酶切位點(diǎn)，以便融合蛋白純化后，通過(guò)腸激酶酶切釋放人β防御素4蛋白，最終獲得與天然人β防御素4蛋白氨基酸序列相同的重組人β防御素4蛋白。并對(duì)重組人p防御素4蛋白的活性進(jìn)行了研究，測(cè)定其體外抗菌活性，本課題研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.構(gòu)建原核表達(dá)載體和優(yōu)化表達(dá)目標(biāo)蛋白：我們以

7、人β防御素4基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR擴(kuò)增人β防御素4基因，雙酶切后與載體pET-42a(+)連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pET42-HBD4。本研究選用的pET原核表達(dá)系統(tǒng)是目前在大腸桿菌(E.coli)中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)，蛋白表達(dá)由宿主菌提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)，非誘導(dǎo)條件下則不存在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，從而使克隆與表達(dá)很好的分離。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚩寺〉捷d體后，重組質(zhì)粒首先

8、選用不含有T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)進(jìn)行克隆，這就避免了對(duì)宿主細(xì)胞有毒的蛋白產(chǎn)物對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；完成克隆后，將其轉(zhuǎn)入染色體上帶有l(wèi)acU V5調(diào)控的T7RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白以可溶的形式表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)需要大量的目的蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，我們對(duì)表達(dá)條件也進(jìn)行了優(yōu)化，最佳表達(dá)條件為：37℃誘導(dǎo)4h，IPTG濃度為0.5mmol/L。 2.重組GST-HBD4融

9、合蛋白的純化：本研究選用了固定化金屬離子親和層析法(IMAC)純化蛋白，它的優(yōu)點(diǎn)是金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性，吸附量大，成本低，純化時(shí)間短。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎳柱純化后，GST-HBD4融合蛋白的純度能達(dá)到90％以上。腸激酶酶切后，再用鎳柱純化HBD4蛋白，純度約為95％，透析脫鹽后，滿足后續(xù)測(cè)活實(shí)驗(yàn)的要求。 3.重組人β防御素4外抗菌活性的研究：通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法初步測(cè)定了重組人β防御素4對(duì)銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色

10、葡萄球菌敏感株(ATCC25923)、大腸埃希菌(ATCC35218)、糞腸球菌(ATCC29212)的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)銅綠假單胞菌活性最強(qiáng)，與報(bào)導(dǎo)一致。我們采用微量稀釋法測(cè)定了重組人β防御素4對(duì)銅綠假單胞菌的體外抗菌效力，結(jié)果證實(shí)，重組人β防御素4有較好的殺菌活性，其對(duì)銅綠假單胞菌的MIC和MBC都是小于哌拉西林和環(huán)丙沙星而略大于亞胺培南，提示其較前兩種傳統(tǒng)抗生素對(duì)銅綠假單胞菌在體外具有更好的殺菌活性。 綜上所述，我們成功構(gòu)