IL-6與動脈粥樣硬化斑塊易損性的關系及影響膠原代謝的機制.pdf

1、背景：
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊不穩(wěn)定性導致的斑塊破裂、血栓形成和血管阻塞是引起急性心腦血管事件的主要原因。易損斑塊的典型特點是：薄的纖維帽，具有大的脂核，伴有膠原含量減少，平滑肌細胞密度降低，巨噬細胞密度及活性增加，活化T細胞浸潤增加；血管外膜可見新生血管及炎癥反應(巨噬細胞、T細胞、肥大細胞增多)。明確易損斑塊的發(fā)生機制對于防止心腦血管事件的發(fā)生具有十分重要的理論及臨床意義。因此，關于易

2、損性斑塊的研究是心血管病的研究熱點之一。動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的結構與斑塊易損性關系較大。纖維帽的完整性和對破裂的抵抗力主要依賴于細胞外基質(zhì)，其中最主要的結構是膠原纖維。纖維帽中膠原的含量主要由膠原合成與降解來調(diào)節(jié)的。斑塊內(nèi)膠原的代謝失調(diào)如膠原合成減少，降解增加均可導致斑塊表面纖維帽變薄，斑塊容易破裂。因此，明確斑塊細胞外基質(zhì)的代謝及調(diào)節(jié)機制對于穩(wěn)定斑塊具有重要意義。許多因素調(diào)節(jié)膠原的合成與降解，任何因素的失調(diào)均可引起膠原代謝的平衡紊亂

3、。膠原合成過程受基因轉錄水平，翻譯水平和翻譯后修飾等調(diào)節(jié)，其中翻譯后修飾有重要的作用。脯氨酸4羥化酶(Prolyl-4-hydroxylase，P4H)是重要的修飾酶，P4H酶的亞型P4Hα1是起作用的關鍵酶。P4Hα1在大多數(shù)組織包括平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞中表達。關于P4Hα1與斑塊易損性的關系尚未見報道?；|(zhì)金屬蛋白酶中的基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)與心血管疾病的形成有關。MMP-14是一個有效的ECM降解酶，它負責許多種細胞

4、外及細胞膜相關的物質(zhì)的蛋白水解作用，包括膠原和其他ECM蛋白。
　　 炎癥反應是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。大量研究證實炎性細胞分泌大量細胞因子如白細胞介素6(interleukin6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin8，IL-8)等可導致內(nèi)皮細胞的活化、平滑肌細胞的增生調(diào)亡及粥樣病變的進展，最終結果是導致纖維帽的膠原成分減少、變薄，易于破裂。IL-6是一個強的炎癥因子，而有關炎性因子IL-6與動脈粥

5、樣硬化斑塊的易損性及斑塊內(nèi)P4Hα1、MMP-14關系的研究未見報道。
　　 目的：
　　 1.觀察IL-6與動脈粥樣硬化斑塊易損性的關系。
　　 2.觀察IL-6與易損斑塊中膠原合成酶P4Hα1及膠原降解酶MMP-14的變化。
　　 方法：
　　 1.易損斑塊動物模型的構建
　　 通過頸動脈套管、限制性應激的方法構建AS易損斑塊動物模型。80只10-12周齡雄性apoE一小鼠分為IL-6

6、刺激組和對照組，每組40只，均給予高脂飲食(含0.25％膽固醇和15％脂肪)。給予實驗動物施行右頸總動脈套管術以誘發(fā)AS病變。頸動脈套管手術4周后，將小鼠放在限制其活動的小籠子中，每次1小時，每天1次，持續(xù)8周。
　　 2.pLVX-AcGFP-N1-IL6重組病毒載體的構建
　　 在平滑肌細胞中提取RNA，逆轉錄成cDNA，然后合成DNA，電泳鑒定并純化，回收目的片段，目的片段與Feasy載體連接，然后擴增、吸收目的片

7、段，使目的片段與病毒載體(GFP)連接，再擴增、提取質(zhì)粒，鑒定后脂質(zhì)體轉染293細胞，最后包裝產(chǎn)毒，-80℃保存。
　　 3.將pLVX-AcGFP-N1-IL6轉入動脈粥樣硬化斑塊：暴露動脈粥樣硬化模型的局部頸動脈，然后將IL-6-HIV滴于局部，孵育20分鐘，將局部縫合。對照組給予局部滴HIV載體。
　　 4.觀察IL-6與動脈粥樣硬化斑塊易損指數(shù)、P4Hα1及MMP-14的關系
　　 4.1病理學檢測：對頸

8、動脈斑塊進行H&E染色以觀察斑塊的形態(tài)結構，測量斑塊面積和纖維帽的厚度，計算斑塊的破裂率；對頸動脈斑塊進行油紅0染色以檢測斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量；對頸動脈斑塊進行天狼猩紅染色以檢測斑塊內(nèi)膠原含量。并通過免疫組織化學方法檢測斑塊內(nèi)巨噬細胞(MOMA-2)、平滑肌肌動蛋白(a-actin)、P4Hα1及MMP-14的蛋白水平。檢測斑塊內(nèi)膠原、脂質(zhì)、巨噬細胞、血管平滑肌細胞的含量，計算易損指數(shù)：易損指數(shù)=(巨噬細胞+脂質(zhì))陽性面積百分比/(平滑肌細胞

9、十膠原)陽性面積百分比。
　　 4.2實時定量RT-PCR檢測：取新鮮頸動脈斑塊組織，提取RNA，實時熒光定量RT-PCR反應檢測P4Hα1和MMP-14 mRNA的表達量。
　　 4.3 Western blot檢測：取新鮮頸動脈斑塊組織，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測斑塊內(nèi)P4Hα1和MMP-14蛋白質(zhì)水平。
　　 結果：
　　 1.pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體的構建：制備載體

10、編碼的攜帶GFP和小鼠IL-6基因的質(zhì)粒載體，轉染HK293細胞，48小時后熒光顯微鏡下觀察。通過基因重組技術構建pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體，PCR反應鑒定，證實反應產(chǎn)物正確。
　　 2.pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體體內(nèi)轉染：pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體轉染3天后頸動脈AS斑塊內(nèi)GFP的表達量為36.07％；轉染14天后斑塊內(nèi)GFP的表達量減少18.81％。
　　 3.血液生化

11、指標檢測：IL-6組和對照組比較血清IL-6濃度增高(分別為81.37±10.79 pg/ml與60.27±9.54pg/ml，P=0.023)，差異有統(tǒng)計學意義，血清TC，TG，HDL-C，LDL-C差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4.IL-6對易損動脈粥樣硬化斑塊的影響
　　 4.1病理學檢測：IL-6組和對照組比較，斑塊面積無顯著性差異(分別為71000±8000 um2和82000±11000um2，P=0.073)，

12、IL-6組纖維帽厚度明顯減少(分別為6.73±0.96 um和7.25±1.35um，P=0.029)，帽/核比值明顯減少(分別為0.06±0.02和0.09±0.02，P=0.045)，膠原含量明顯減少(分別為11.23％±3.57％和16.34％±4.72％，P=0.005)，脂質(zhì)含量明顯增加(分別為21.23％±3.56％和12.25％±2.01％，P=0.0011)。 IL-6組有1例斑塊破裂并血栓形成，1例斑塊內(nèi)出血，1例斑塊

13、內(nèi)埋藏的纖維帽，2例纖維帽中斷；對照組有1例斑塊內(nèi)埋藏的纖維帽，1例纖維帽中斷，未見血栓和出血現(xiàn)象。IL-6組和對照組比較，a-SMC-actin明顯減少(分別為5.77％±1.09％和11.97％±1.92％，P=0.017)，巨噬細胞明顯增加(分別為15.32％±3.01％和7.67％±2.87％，P=0.004)， IL-6明顯增加(分別為12.32％±1.44％和6.89％±0.57％，P=0.021)，P4Hα1明顯減少(分別

14、為5.01％±0.46％和9.35％±1.24％，P=0.028)，MMP-14明顯增加(分別為9.78％±0.98％和4.29％±0.31％，P=0.019)。與對照組比較，IL-6組易損指數(shù)明顯增加(分別為2.83±1.02和0.81±0.43，P=0.009)。
　　 4.2實時定量RT-PCR檢測
　　 與對照組相比，IL-6組頸動脈斑塊組織中P4Hα1 mRNA的表達量減少69.3％，兩組間統(tǒng)計學差異具有顯著性

15、意義(P=0.03)。與對照組相比，IL-6組頸動脈斑塊組織中MMP-14 mRNA的表達量增加77.2％，兩組間統(tǒng)計學差異具有顯著性意義(P=0.028)。
　　 4.3免疫印跡(Westenr blot)檢測：與對照組相比，IL-6組頸動脈斑塊組織中P4Hα1蛋白的表達量減少61.9％，兩組間存在顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；與對照組相比，IL-6組頸動脈斑塊組織中MMP-14蛋白的表達量增加56.3％，兩組間存在顯著的

16、統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.體內(nèi)實驗結果表明，pLVX-AcGFP-N1-IL6顯著增加斑塊內(nèi)巨噬細胞和脂質(zhì)的含量，降低斑塊內(nèi)平滑肌細胞及膠原的表達，從而增加斑塊的易損性。
　　 2.體內(nèi)實驗結果表明，pLVX-AcGFP-N1-IL6能抑制斑塊局部P4Hα1 mRNA的表達和減少P4Hα1蛋白的含量；pLVX-AcGFP-N1-IL6能增強斑塊局部MMP-14 mRNA的表達和增加MM