BRD7蛋白的抗體制備和其在結直腸癌中的表達及臨床意義.pdf

1、BRD7的研究背景
　　 BRD7是我室新近克隆的鼻咽癌相關基因，是一個含Bromodomain的核轉錄因子。BRD7基因的過表達可通過調(diào)節(jié)MAPK及Wnt信號通路抑制鼻咽癌的生長，并將鼻咽癌阻滯在G1/S期。前期研究表明，BRD7不僅在鼻咽癌活檢組織中表達下調(diào)，RT—PCR結果顯示BRD7在結直腸癌細胞中也表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。因此，本文在前期工作基礎上，通過制備BRD7抗體，進一步分析BRD7在結直腸癌中的表達及其臨床意義。

2、r>　　 GST-BRD7N融合蛋白的表達與純化
　　 從人胎腦文庫PCR擴增編碼BRD7蛋白N端353個氨基酸的BRD7基因片段，定向克隆到原核表達載體pGEX-4T—1。陽性重組質粒經(jīng)PCR和測序鑒定，導入大腸桿菌BL21原核表達系統(tǒng)。37℃0.5mM IPTG誘導細菌3.5小時，BL21高效表達預期的64kDa GST-BRD7N融合蛋白。親和層析純化后，純化蛋白的總量超過2 mg/600μl。純化蛋白的濃度為1.5 m

3、g/ml。在純化過程中，GST—BRD7N蛋白沒有發(fā)生降解，保持了完整性。
　　 抗BRD7多克隆抗體的制備
　　 用純化的GST-BRD7N融合蛋白對兩只新西蘭兔共進行了5次免疫。在初次免疫100天后，收集抗血清，進行親和純化。ELISA結果表明，純化的兔抗BRD7抗體的滴度為1：1，000，000。SDS—PAGE結果顯示，兩只兔子的BRD7抗體的濃度分別為300μg/ml和150μg/ml。純化的BRD7抗體特異識

4、別pCMV—Myc—BRD7轉染COS7細胞中分子量為75kDa的全長重組融合蛋白Myc—BRD7。為進一步研究BRD7抗體的特異性，我們還進行了免疫沉淀分析。在由BRD7抗體沉淀的免疫復合物中，用c—Myc抗體檢測到了Myc—BRD7蛋白的表達。同樣，在由c—Myc抗體沉淀的免疫復合物中，用BRD7抗體也檢測到了Myc—BRD7蛋白的表達。
　　 用抗BRD7抗體檢測人胚胎組織中BRD7蛋白的組織表達譜
　　 分別采用

5、Western blot和免疫組化方法，分析了BRD7基因在11種人胚胎組織中的蛋白表達情況。Western blot結果顯示，BRD7在大多數(shù)所檢測人胚胎組織中表達。比較不同組織BRD7蛋白表達水平，BRD7蛋白在小腦、心肌、胰臟相對高表達，在腸、肝、腎中度表達，而在大腦、肺、脾、胃相對低表達。免疫組化實驗表明，BRD7蛋白在心肌呈強陽性表達，且主要位于細胞漿，而在小腦、胰、腸、肝、腎、大腦、肺、脾、胃則主要分布在細胞核，其中，小腦、

6、胰、腸、肝、腎為強陽性表達，大腦、肺、脾、胃為弱陽性表達。
　　 結直腸癌組織微陣列的制作
　　 成功制作了包括103例原發(fā)性結直腸癌病人腫瘤組織和103例配對正常結直腸上皮組織的結直腸癌組織微陣列。每例標本設置3個平行組織點，組織直徑0.5mm。組織微陣列切片經(jīng)HE染色，鏡下觀察切片質量。結果證實切片厚度適中，細胞形態(tài)均一，組織結構無破壞。
　　 結直腸癌BRD7蛋白表達及其臨床意義
　　 采用高通量的

7、組織芯片和免疫組化技術相結合的方法，對102例結直腸癌組織和99例匹配正常結直腸上皮組織BRD7蛋白的表達水平進行了檢測分析。免疫組化陽性的多數(shù)樣本(75％)BRD7蛋白主要定位分布在胞核。20％樣本BRD7蛋白在胞核和胞漿中均有陽性表達。約5％免疫組化陽性樣本BRD7蛋白只在胞漿中表達分布。73例(71.6％)結直腸癌和84例(84.9％)配對正常結直腸上皮細胞中BRD7蛋白表達陽性。和配對正常結直腸上皮組織比較，結直腸癌組織樣本中B

8、RD7蛋白陽性表達率顯著下調(diào)(p=0.023)。
　　 進一步分析BRD7蛋白表達水平和結直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關系。發(fā)現(xiàn)結直腸癌BRD7蛋白表達缺失與腫瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴結轉移有關：①腫瘤直徑≥4.0cm的病人組織樣本中BRD7蛋白陽性表達率明顯下調(diào)，BRD7蛋白在直徑≥4.0 cm腫瘤中陽性表達率為64.8％，而在直徑<4.0cm腫瘤中BRD7蛋白陽性表達率為87.1％(p=0.031)；②結直腸癌D

9、ucks分期中，C期(62.0％)和D期(64.0％)的BRD7蛋白陽性表達率顯著低于A期(92.9％)和B期(76.5％)(p=0.041)；③TNM分期中，臨床Ⅲ期的結直腸癌(64.2％)組織樣本中BRD7蛋白陽性表達率明顯低于臨床Ⅰ期(100％)和臨床Ⅱ期(80.0％)(p=0.041)；④伴淋巴結轉移(62.0％)的結直腸癌組織中BRD7蛋白陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移的結直腸癌組織(80.8％)(p=0.036)。而BRD7

10、蛋白表達水平和結直腸癌分化水平、腫瘤位置、腫瘤遠處轉移、病人性別以及病人年齡無關(p>0.05)。
　　 綜上所述，本文首次研究了BRD7基因在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義。通過構建pGEX-4T—RD7N重組原核表達載體，獲得了純化的原核誘導表達的GST-BRD7N融合蛋白；通過免疫新西蘭兔和免疫吸附實驗，制備了高效價和高特異性的抗BRD7多克隆抗體，應用該抗體，檢測分析了人胚胎BRD7的組織表達譜；借助成功制作的結直腸癌