醫(yī)用臭氧對體外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元的毒性研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度醫(yī)用臭氧對體外培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元的損傷作用，并初步探討其損傷機制。 方法：從孕14天Wistar大鼠胚胎組織中獲取脊髓神經(jīng)元，體外培養(yǎng)至第6～7天，免疫熒光化學方法行細胞純度鑒定。將鑒定后的脊髓神經(jīng)元分成5組，分別為對照組、氧氣組、20μg/mL、40μ/mL和60μ/mL臭氧組。利用真空泵將膠塞密封好的培養(yǎng)瓶內(nèi)壓力降至-0.6kPa，除對照組外，其余各組注入濃度分別為20，40和60μg/mL的醫(yī)用臭氧及氧

2、氣各20mL。氣體干預20分鐘后，將培養(yǎng)瓶放回孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育2.5小時。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化，Hoechst33258熒光染料顯示細胞核損傷，提取全細胞蛋白行生化指標及蛋白檢測。選用黃嘌呤氧化酶法測定細胞SOD水平、硫代巴比妥酸法測定細胞MDA水平、簡易測定法測定細胞LDH漏出率。采用Western Blot檢測Bcl-2，Bax及MAP2的表達水平變化。 結果： （1）細胞培養(yǎng)及純度鑒定：細胞培養(yǎng)至第6～

3、7天，熒光顯微鏡下觀察MAP-2陽性神經(jīng)元的純度為87.70±8.70％； （2）光鏡下細胞形態(tài)學改變：發(fā)皰細胞為最為常見也最具特色的形態(tài)學改變且隨臭氧濃度升高，神經(jīng)元突起扭曲斷裂，表現(xiàn)為串珠樣改變； （3）Hoechst33258示DNA形態(tài)學變化：對照組細胞為均勻一致的淡藍色；氧氣組神經(jīng)元細胞核DNA出現(xiàn)斷裂、邊集；臭氧干預組神經(jīng)元染色質濃縮發(fā)亮且呈劑量相關； （4）生化指標檢查：SOD，MDA及LDH的測定值均隨

4、著臭氧干預濃度升高而升高，MDA與LDH升高較早（40μg/mL），且曲線斜率較之SOD更大。 （5）Western Blot檢測凋亡蛋白：隨著臭氧干預濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平未見明顯趨勢，而凋亡蛋白Bax的表達水平卻有穩(wěn)定的上升。神經(jīng)元微管相關蛋白2的表達水平隨著臭氧干預濃度的升高而不斷下降。 結論：醫(yī)用臭氧對于體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元具有細胞毒作用，在較低干預濃度下（20μg/mL），脊髓神經(jīng)元表現(xiàn)出非常