人DC分泌的EXO負載抗原結(jié)合polyI：C促進轉(zhuǎn)基因小鼠抗腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、本文對人樹突狀細胞（hDC)分泌的EXO負載NY-ESO-1抗原促進轉(zhuǎn)基因小鼠特異性CTL擴增及增強殺傷腫瘤效應(yīng)進行了研究。本實驗通過貼壁法，選用HLA-A2陽性健康成人的外周白膜血分離PBMC，使用rhGM-CSF和rhIL-4將PBMC體外誘導(dǎo)一周，成為未成熟的人DC（ihDC），加入自身淋巴細胞制成的凍融抗原用以增加外泌體（Exosomes,EXO）分泌量。再加入促成熟因子脂多糖（LPS），24小時后得到成熟的人DC（mhDC）。

2、收集mhDC培養(yǎng)體系的上清，利用一系列不同速度離心結(jié)合膜過濾的方法，從其上清中提取mhDC分泌的EXO。使用冰浴的方法，人工負載腫瘤睪丸抗原(CTA)NY-ESO-1肽段于經(jīng)過蛋白定量和酸洗之后的EXO（EXOAg）上。使用這種EXOAg（10ug）與polyI:C(50ug)在右后腿內(nèi)側(cè)皮下部位聯(lián)合注射，免疫健康HLA-A2轉(zhuǎn)基因C57小鼠。四周后，取脾細胞進行功能實驗。同時，將小鼠雙后肢骨髓沖出，利用小鼠骨髓造血干細胞多向分化的潛能

3、，在培養(yǎng)體系中加入小鼠粒系單核系集落刺激因子（rmGM-CSF）體外誘導(dǎo)成為未成熟的小鼠DC（imDC）,用于隨后的NY-ESO-1抗原肽是否能促imDC成熟的驗證實驗。給imDC中加入LPS，24小時后成為成熟的小鼠DC（mmDC），用于小鼠脾細胞的體外孵育。通過人HLA-A2分子與鼠免疫球蛋白(IgG1)嵌合的四聚體結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)脾細胞中NY-ESO-1抗原特異的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxin T lympha cell，CT

4、L）有所擴增。通過DiOC－18聯(lián)合PI的方法，測定脾細胞對表達NY-ESO-1抗原的慢性粒細胞性白血病細胞系（K562細胞系）有一定殺傷效應(yīng)。體外刺激實驗步驟如下：mmDC先與EXOAg在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時后，再加入分離出的小鼠脾細胞以及重組小鼠白介素2（rmIL-2）100IU/mL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育一周，補加mmDC和rmIL-2，至第二周進行四聚體實驗和DiOC－18聯(lián)合PI殺傷實驗。體外兩輪刺激實驗結(jié)果顯示