磷酸肌酸鈉對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外作用及其機制研究.pdf

1、目的：心臟毒性是抗腫瘤藥物常見的不良反應(yīng)之一，尤其是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物最為明顯。磷酸肌酸鈉（Creatine Phosphate Sodium，CP）作為一種高能磷酸化合物，不僅可以在心肌細(xì)胞遭受缺血缺氧時為其提供能量，還可以保護(hù)心肌細(xì)胞膜免受氧自由基等有害物質(zhì)的侵襲。作為心肌保護(hù)劑已被廣泛應(yīng)用于心臟內(nèi)外科臨床。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞是高耗能細(xì)胞，應(yīng)用磷酸肌酸可能會促進(jìn)腫瘤的生長。本研究通過體外試驗探討磷酸肌酸鈉對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖

2、的影響，并對可能存在的機制進(jìn)行初步的探討，從而為腫瘤患者是否能夠應(yīng)用磷酸肌酸來保護(hù)心臟提供參考依據(jù)。
　　 方法：1選取人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（tetrzolium-based colorimetric assaly，MTT）法檢測磷酸肌酸鈉不同濃度組（1、6、12mmol/L）、不同時間組（24、48、72h）對細(xì)胞存活和生長的影響情況。2流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測

3、磷酸肌酸鈉對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。3根據(jù)MTT的結(jié)果，設(shè)置對照組及實驗組，分別提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（revers transcription.PCR，RT-PCR）半定量檢測磷酸肌酸鈉處理前后SKOV3細(xì)胞中CyclinDlmRNA、Bcl-2mRNA的表達(dá)水平。4采用流式細(xì)胞術(shù)檢測磷酸肌酸鈉處理前后SKOV3細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化。
　

4、　 結(jié)果：1 MTT結(jié)果顯示：磷酸肌酸鈉（1、6、12mmol/L）對SKOV3細(xì)胞具有抑制增殖的作用。磷酸肌酸鈉1 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞24、48、72h后，與對照組相比，OD值有所下降，但差異無顯著性（P>0.05）。磷酸肌酸鈉6、12mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞24、48、72h后，與對照組相比，OD值均有不同程度的下降，差異具有顯著性（P<0.05）。隨著磷酸肌酸鈉處理濃度的增大、作用時間的延長，抑制率逐漸升高

5、，即磷酸肌酸鈉對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h的增殖抑制作用最明顯。2流式細(xì)胞儀檢測SKOV3細(xì)胞凋亡和周期分布顯示，1、6、12mmol/L磷酸肌酸鈉作用SKOV3細(xì)胞72h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少。即磷酸肌酸鈉可阻滯SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，該作用呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。1、6、12mmol/L磷酸肌

6、酸鈉作用SKOV3細(xì)胞72h后，未出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡百分率與對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。3 RT-PCR檢測結(jié)果顯示：磷酸肌酸鈉不同濃度組處理SKOV3細(xì)胞72h后，CyclinD1mRNA有不同程度的降低。磷酸肌酸鈉1mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，CyclinD1mRNA表達(dá)有所降低，但與對照組比較差異無顯著性（P>O.05）。磷酸肌酸鈉6、12 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，Cycli

7、nD1mRNA表達(dá)降低，與對照組比較差異具有顯著性（P<0.05）。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組作用72h對SKOV3細(xì)胞CyclinD1mRNA表達(dá)抑制最顯著。磷酸肌酸鈉1、6、12 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，Bcl-2mRNA表達(dá)水平與對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。4流式細(xì)胞術(shù)檢測CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：0、1、6、12mmol/L磷酸肌酸鈉處理SKOV3細(xì)胞72h后，SKOV3

8、細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（FI值）分別為1、0.988、0.863、0.718，Bcl-2蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（FI值）分別為1、0.977、0.947、0.912。對于CyclinD1蛋白，磷酸肌酸鈉1mmol/L組與對照組的FI值相比，差異不具有顯著性（P>0.05）；磷酸肌酸鈉6、12mmol/L組與對照組的FI值相比，差異具有顯著性（P<0.05）。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組作用72h對SKOV3細(xì)胞CyclinD

9、1蛋白表達(dá)抑制最顯著，與RT-PCR結(jié)果一致。對于Bcl-2蛋白，磷酸肌酸鈉1、6、12mmol/L組與對照組的FI值相比，差異無顯著性（P>0.05），與RT-PCR結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1本實驗證實一定濃度范圍內(nèi)，磷酸肌酸鈉能夠抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。
　　 2磷酸肌酸鈉作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞后未見誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平未見明顯變化。
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