ROG負向調(diào)控T淋巴細胞因子表達機制的研究.pdf

1、哮喘發(fā)病的核心機制是Th1/Th2細胞因子比例的降低,而Th1細胞因子與Th2細胞因子之間存在交互抑制作用,故抑制對Th2細胞因子表達具有促進作用的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3,或刺激對Th1細胞因子表達具有促進作用的轉(zhuǎn)錄因子T-bet,被認為是糾正哮喘T淋巴細胞(T細胞)因子失衡的有效途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)了-個可抑制GATA-3功能的轉(zhuǎn)錄因子ROG(Repressor of GATA-3),在其高表達的CD4+T細胞,Th1細胞因子和Th2細胞

2、因子的表達均受到抑制,但機制不明。闡明ROG負向調(diào)控T細胞因子表達的確切機制,對于明確哮喘T細胞因子失衡機理,具有重要意義。 ROG是一種淋巴細胞特異性基因,所表達的蛋白是抑制性鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一個新成員。初期研究發(fā)現(xiàn),在初始CD4+T細胞受到抗CD3刺激后的早期,ROG即可迅速表達,并可明顯抑制GATA-3誘導的反式激活,完全抑制GATA-3對IL-4和IL-5啟動子的激活,因此命名為GATA-3抑制因子；深入研究發(fā)現(xiàn),在對

3、CD4+T細胞轉(zhuǎn)染ROG基因后,Th1、Th2細胞因子的表達量均明顯下降。ROG抑制Th2細胞因子的表達可能是部分或者完全通過其對GATA-3的抑制所實現(xiàn),但其抑制Th1細胞因子的途徑,尚不得而知。除GATA-3外,ROG的下游應(yīng)該另有負向調(diào)控T細胞因子表達的靶點。 基于目前對T細胞因子表達調(diào)控機制的研究進展,ROG調(diào)控T細胞因子表達的可能靶點包括:T細胞膜上的CD3分子(T細胞胞膜第一信號)、T細胞膜上的共刺激信號分子如CD2

4、8、可誘導T細胞共刺激分子(Inducible T cellcostimulator,ICOS)、細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T-LymphocyteAntigen 4,CTLA-4)等(T細胞胞膜第二信號)、胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路分子CD45等(T細胞胞漿內(nèi)信號)。在對這些信號分子的特點進行分析后,我們提出以下假設(shè):ROG是通過直接或間接抑制CD3、CD28、ICOS等對T細胞因子表達具有刺激作用的分子,或通過間接刺

5、激CTLA-4、CD45等對T細胞因子表達具有抑制作用的分子,從而抑制T細胞因子的表達。 為了驗證以上假設(shè),并揭示相關(guān)的機制,我們設(shè)計了以下研究方案：首先,以熒光定量PCR和Western Blot分別了解初始狀態(tài)的Th1、Th2細胞中ROG及CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的基礎(chǔ)表達狀況,并以ELISA分別檢測Th1、Th2細胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達狀況；其次,以ROG-pcD

6、NA3.1分別轉(zhuǎn)染Th1、Th2細胞,誘導Th1、Th2細胞中的ROG表達上調(diào),分別采用熒光定量PCR和Western Blot方法觀察Th1、Th2細胞中CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表達變化情況,并以ELISA分別檢測Th1、Th2細胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達狀況；最后,以ROG-siRNA分別轉(zhuǎn)染Th1、Th2細胞,誘導Th1、Th2細胞中的ROG表達下調(diào),分別采用熒光定量PCR

7、和Western Blot方法觀察Th1、Th2細胞中CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表達變化情況,并以ELISA分別檢測Th1、Th2細胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達狀況。 結(jié)果顯示,在初始狀態(tài)的Th1、Th2細胞中,ROG的表達水平較低(P<0.01)。與初始狀態(tài)的Th1、Th2細胞相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th1、Th2細胞中,ROG的表達量顯著升高(P<0.01),伴隨ICOS

8、的表達量顯著降低(P<0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表達狀況無顯著性改變(P>0.05);與初始Th1細胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th1細胞的培養(yǎng)液中,IFN-γ的表達量顯著降低(P<0.01),而與初始Th2細胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th2細胞的培養(yǎng)液中,IL-4的表達量顯著降低(P<0.01)。與初始狀態(tài)的Th1、Th2細胞相比,經(jīng)ROG基因表達沉默的Th1、Th2細胞中,ROG的表達量顯

9、著降低(P<0.01),伴隨ICOS的表達量顯著升高(P<0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表達狀況無顯著性改變(P>0.05);與初始Th1細胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因表達沉默的Th1細胞的培養(yǎng)液中,IFN-γ的表達量顯著升高(P<0.01),而與初始Th2細胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因表達沉默的Th2細胞的培養(yǎng)液中,IL-4的表達量顯著升高(P<0.01)。 由以上實驗結(jié)果可知,ROG表達上調(diào)可通過抑

10、制ICOS表達而抑制T細胞因子表達,ROG表達下調(diào)可通過促進ICOS表達而促進T細胞因子表達,即ROG可通過負調(diào)控ICOS的表達而負調(diào)控T細胞因子的表達。通過生物信息學研究發(fā)現(xiàn),在ICOS的啟動子區(qū)包含有GATA-1區(qū),而后者與GATA-3具有76％的同源性,且GATA-1和GATA-3都是對基因轉(zhuǎn)錄具有重要啟動作用的轉(zhuǎn)錄因子,因此,推測ROG對ICOS表達的抑制作用是通過其對GATA-1的抑制作用而間接導致。 本研究豐富了RO