環(huán)境因子對副溶血弧菌T3SS基因表達的影響及養(yǎng)殖環(huán)境細菌多樣性分析.pdf

1、為完善海水養(yǎng)殖病害的防御監(jiān)測機制，通過研究溫度、鹽度和pH等環(huán)境因素對副溶血弧菌Ⅲ型分泌系統(T3SS)基因表達的影響，推斷不同環(huán)境因子影響下副溶血弧菌致病性的差異，以探討環(huán)境因子與副溶血弧菌T3SS基因表達及致病性和環(huán)境適應性之間的關系，為水產品疾病的防治等研究奠定基礎。同時使用宏基因組測序技術對大菱鲆養(yǎng)殖水體和病魚腹水水體的細菌菌群多樣性和相對豐度進行了研究，為大菱鲆養(yǎng)殖過程中的病害防治提供背景資料。
　　以副溶血弧菌ATCC

2、17802和JA21作為實驗菌株，設置不同培養(yǎng)溫度和溫度應激兩種培養(yǎng)條件，以pvuA為內參基因，以副溶血弧菌T3SS1的 vcrD1、vopS、vopD1和T3SS2的vscC2β、vcrD2β、vopP2β為目的基因，運用熒光定量PCR技術檢測T3SS相關基因在不同生長溫度和溫度應激條件下的表達，用ΔΔCt法計算基因表達差異。結果表明，副溶血弧菌ATCC17802的T3SS1基因在16℃表達量最高，T3SS2基因在25℃表達量最高；J

3、A21的T3SS基因在25℃表達量最高。T3SS2能夠破壞腸道組織，并且具有一定的細胞毒性，是發(fā)揮感染作用的重要毒力因子，由此暗示在25℃條件下，養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌對受感染宿主有較強的致病性。
　　2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉入到應激溫度37℃后，T3SS1和T3SS2基因的表達量均被顯著誘導，并表現出時間依賴性，呈現先升高后降低的趨勢。這為進一步探究環(huán)境因素與副溶血弧菌致病力的關系提供了科學依據。
　　采用RT-P

4、CR的方法，檢測了ATCC1702和JA21這2株副溶血弧菌的T3SS基因在不同鹽度和pH條件下的表達差異。發(fā)現當鹽度在2.5％～3.5%之間時，2株副溶血弧菌T3SS基因表達量最低，而0.5%、5%、8%等過低或過高鹽度下T3SS表達量顯著增高；2株副溶血弧菌的T3SS在pH為9的堿性環(huán)境下表達量顯著升高，反應強烈；酸性環(huán)境能適度誘導T3SS2的表達量升高，卻不足以誘導T3SS1的表達。
　　設計通過CRISPR/cas9系統構

5、建副溶血弧菌Δhns-ATCC17802突變株，熒光定量PCR方法檢測在環(huán)境因子刺激下Δhns突變株的T3SS1及exsA、exsD的表達情況，并以標準株ATCC17802為對照，研究H-NS是否可以響應環(huán)境因子的刺激，對T3SS1的表達做出調控。由于未能成功構建出hns缺失株，實驗未獲成功，初步分析與啟動子的識別有關。計劃下一步將從這些方面著手研究。
　　采用高通量測序技術評估了大菱鲆養(yǎng)殖水體和患病大菱鲆腹水水體樣本的細菌群落的